不同碳氮源对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白的影响研究

郭 刚楚 杰王君高刘可春

(1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南 250353；2.山东省科学院生物研究所，山东济南 250014)

在羽毛中，粗蛋白含量高达80%以上，其中主要为角蛋白，角蛋白中除赖氨酸、蛋氨酸的含量较低外，其它动物必需氨基酸均略高于鱼粉（刘雪兰等，1999）。近年来，国内禽畜行业快速发展，动物饲料蛋白源不足的问题越来越严重；我国是羽毛产量大国，年产羽毛在70万吨以上，由于羽毛很难降解，对于环境造成很大压力；所以，充分地利用羽毛，不仅可以一定程度缓解我国动物饲料蛋白源不足的问题，还可以减轻甚至消除大量羽毛不能降解而对环境造成的压力。

羽毛的难降解主要是因为在角蛋白的分子链内和分子链之间广泛存在着二硫键、氢键、盐键及其他的交联作用，这些交联作用，具有很强的抗降解能力。现在降解羽毛的方法主要有三类：高温高压蒸煮、化学法（酸水解和碱水解）、酶法。高温高压蒸煮法不但会破坏掉热敏性的动物必需的氨基酸，生成一些无营养价值的氨基酸，而且比较耗能，影响到羽毛作为动物饲料的经济效益，而化学法同样存在着会破坏掉一些营养氨基酸的问题，并且化学法的后续处理会生成大量的盐类,影响饲料的口感，使动物少进食,甚至不进食,与前两类方法相比,酶法处理条件温和,不会破坏掉营养氨基酸，并且不会影响口感,所以,酶法降解羽毛成为了一种很有前景的方法,但是由于角蛋白分子内与分子间交联作用的广泛存在,常见的蛋白酶,如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶都很难降解角蛋白。

目前，已经分离筛选出30多株降解角蛋白的菌株（Onifade A A 等，1998），主要为细菌、放线菌和真菌，它们通过分泌一种诱导酶——角蛋白酶来对角蛋白进行降解。虽然菌体本身对角蛋白酶的产生起着决定作用,但是与培养基组分和培养条件也有很大关系,如温度、pH值、碳氮源等。虽然有报道（Manczinger L等，2003）发现，降解角蛋白的一些菌体能自身合成微量的合成型角蛋白酶，但是，底物诱导还是调节角蛋白酶合成的主要机制。Santos RMDB等（1996）发现，葡萄糖能抑制角蛋白酶的产生，进而影响角蛋白的降解，而Anbu P等（2008）的发现却与此相反，此外，El-Naghy MA等（2008）发现，氮源能够部分甚至完全抑制角蛋白酶的产生。

近年来，国内为了提高对羽毛的利用率，对角蛋白酶进行了大量研究，然而，酶活力低一直是提高羽毛利用率的瓶颈。地衣芽孢杆菌S6是本实验室筛选到的降解羽毛能力很强的菌株，本实验通过选择9种碳源（葡萄糖、葡萄糖酸钠、甘露糖、甘露醇、木糖、蔗糖、乳糖、异戊醇）与8种氮源（碳酸铵、氯化铵、硝酸钠、半胱氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、尿素、肌酸），对羽毛蛋白的降解特性进行较系统的研究，不仅为提高角蛋白酶活力奠定一定的理论基础，而且对于工业上提高羽毛蛋白的利用率具有重要意义。

1 材料方法

1.1 菌种

本实验室保藏。

1.2 培养基

种子培养基(g/l)：酵母膏 5、蛋白胨10、氯化钠10、琼脂 20，pH 值 7.0。

发酵培养基(g/l):羽毛10、磷酸二氢钾0.5、磷酸氢二钾 1.2、氯化钠 0.5、硫酸镁 0.1、氯化钙 0.2，pH 值7.0，在此基础上分别添加碳源与氮源，其中碳源添加量为0.05 mol/l，氮源添加量为0.01 mol/l，121℃条件下，灭菌20 min。

1.3 羽毛采集

新鲜羽毛取自市场肉鸡宰杀点。

1.4 羽毛处理

自来水洗净羽毛，70℃烘干，培养基用羽毛为完整羽毛，测酶活用羽毛为挑选出的绒毛，剪碎。

1.5 主要仪器

超净台、培养箱、分光光度计、摇床、水浴摇床、离心机。

1.6 摇瓶发酵

取培养14 h的种子液1 ml，接种于装有30 ml发酵培养基的250 ml三角瓶中，37℃、100 r/min，培养72 h。

1.7 酶活测定

参照蔡成岗等(2009)测定角蛋白酶酶活的方法，略有改动：取5 ml发酵液，5 000 r/min，离心10 min，取1 ml上清液加入盛有10 mg羽毛与2 ml pH值8.0的0.05 mol/l Tris-HCl离心管中,其余上清液以备测定可溶性蛋白，50℃、100 r/min条件下反应1 h后，加入2 ml 10%TCA 终止反应，5 000 r/min，离心 10 min，用pH值8.0的0.05 mol/l Tris-HCl把上清液稀释2倍，然后在280 nm处测定吸光度，空白组同试验组，在加上清液前加入2 ml 10%TCA。酶活单位定义为试验组对空白组每增加0.01吸光度所需要的酶量。

1.8 可溶性蛋白测定

可溶性蛋白的测定参照陈钧辉等（2003）的方法。

1.9 pH测定

pH测定采用pH计测定方法。

1.10 数据处理

每个测定量3个重复，取值均为其均值，数据处理通过Excel 2007和SPSS 17.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白的影响

在微生物细胞中，碳源不仅是微生物生长重要的结构物质，还是微生物生长代谢重要的能源承担者，此外，碳源还是一些大分子合成所必须的中间体，并且在微生物细胞内的信息传递中起着重要的作用。角蛋白酶是种诱导酶，具有底物直接诱导及对诱导物特异性要求较低的特点(李江等，2006)，碳源作为微生物生长代谢的重要营养物质，是影响角蛋白酶产生的重要因素，对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白的能力影响很大。

在本试验开始之前，首先对灭菌后的发酵液pH值进行测定(结果未列出)，发现外加碳源处理对溶液改变较少，所以在后续的发酵中未作调节。基于以前的研究，地衣芽孢杆菌S6在以羽毛为唯一碳氮源发酵，72 h后，可溶性蛋白量和酶活力达到最高。外加不同碳源处理的发酵液（碳源浓度均为0.05 ml/l）中，地衣芽孢杆菌S6降解羽毛72 h的酶活力，可溶性蛋白量如图1、表1。

表1 不同碳源处理发酵液可溶性蛋白量比较

从图1可以看出，除外加异戊醇的发酵上清液角蛋白酶活力低于没有外加碳源发酵上清液角蛋白酶活力外，其它外加碳源的发酵上清液角蛋白酶活力均明显高于没有外加碳源发酵上清液角蛋白酶活力，其中以麦芽糖为最显著，与没有外加碳源发酵上清液角蛋白酶的活力相比，提高近3倍。

利用SPSS17.0选用P＜0.05时，对获得试验数据单因素方差分析，表明不同的外加碳源发酵液酶活力之间差异具有显著性，在此基础上进行多重比较表明，外加碳源的处理组和没有添加碳源发酵液角蛋白酶活力之间的差异均具有显著性，其中，异戊醇抑制了发酵液中角蛋白酶的活力，其它的都对发酵中角蛋白酶活力起到促进作用，其中，尤以添加麦芽糖的发酵液酶活力提高最多。

从表1可以看出，没有外加碳源的发酵液可溶性蛋白只有226.05 μg/ml，而外加麦芽糖的发酵液可溶性蛋白量最高,达到30 672.07 μg/ml,提高了近135倍,除异戊醇、葡萄糖酸钠外，其它碳源对发酵液可溶性蛋白量的影响也很显著。

从图1、表1中可以发现，虽然在发酵液体系中，可溶性蛋白的产生是由于角蛋白酶降解羽毛蛋白产生的，但可溶性蛋白量和酶活力之间在数值并没有显著的相关性，这主要是因为在羽毛蛋白的降解过程中，可溶性蛋白的量是动态变化的，它不断的产生，同时，也会被地衣芽孢杆菌S6不断的利用，以维持其正常的生理代谢。

2.2 不同氮源对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白的影响

氮源是微生物生长所需要的重要营养物质，氮在微生物细胞的干重中占到12%～15%，是构成蛋白质、核酸的重要元素。氮源作为微生物生长的重要营养物质，同样是影响角蛋白酶产生的重要因素，对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白也有很大影响。

通过对灭菌后外加氮源的发酵液初始pH值测定发现，外加碳酸铵、尿素的发酵液初始pH值变化较大，对它们分别调节之后，进行后续的发酵试验。

发酵72 h后，外加不同氮源发酵液（氮源浓度均为0.01 ml/l）的酶活力，可溶性蛋白量如图2、表2。

表2 不同氮源处理发酵液可溶性蛋白量比较

从图2可以看出，与能提高角蛋白酶产量的碳源相比，氮源对产生角蛋白酶的影响相对较弱，在外加氮源的处理中，半胱氨酸对角蛋白酶活力的影响最大，然而，与外加碳源相比，除外添加异戊醇的处理抑制了角蛋白酶的产生外，其它外添加碳源的影响均大于外添加半胱氨酸的影响，其中，外添加麦芽糖的发酵上清液的酶活力是外添加半胱氨酸的发酵上清液酶活力的两倍多。在外加氮源的处理中，除半胱氨酸和甘氨酸外，其余外加氮源的发酵液角蛋白酶活力均比没有外加氮源的发酵液角蛋白酶活力低。

使用SPSS17.0对获得酶活力数据处理，当P＜0.05，单因素方差处理的结果表明各处理间差异显著，在此基础上进行多重分析，外加碳酸铵、氯化铵、尿素、半胱氨酸的发酵液酶活力均与没有添加氮源的发酵液酶活力之间差异具有显著性，其中，尿素、碳酸铵、氯化铵抑制了发酵液的酶活力，而半胱氨酸提高了发酵液的角蛋白酶活力。

从表2可以看出,各氮源处理组可溶性蛋白量之间的差异要比各碳源处理组之间可溶性蛋白量之间的差异小的多,并且,各氮源对可溶性蛋白量的影响也较小,最高的为外加甘氨酸的发酵液,为582.46 μg/ml。

从图2、表2可以发现，与碳源类似，外加氮源的发酵液中可溶性蛋白量和酶活力之间在数值并没有显著的相关性，这也主要是因为可溶性蛋白量是动态变化的。

3 讨论与结语

碳氮源是微生物生长必须的两类最重要的营养物质，角蛋白酶是种诱导酶，具有底物直接诱导和对诱导源要求较低的特点，本试验通过外加不同的碳氮源对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白的影响进行研究发现，总体而言，碳源对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛蛋白的影响要比氮源大的多，这从发酵液的酶活力和可溶性蛋白量可以看出，外加碳源组发酵液角蛋白酶活力最高达到224.5 U/ml，可溶性蛋白最高达到30 672.07 μg/ml，而外加氮源组发酵液角蛋白酶活力最高为101.55 U/ml,可溶性蛋白最高只为582.46 μg/ml。

Santos RMDB等发现，一些糖类能抑制角蛋白酶的产生，进而影响角蛋白的降解，但在本试验中，大部分碳源不仅没有抑制角蛋白酶的活力，反而极大提高了角蛋白酶的活力，很大程度上促进了羽毛蛋白的降解，本试验外加氮源对地衣芽孢杆菌S6降解羽毛的影响与El-Naghy M A等的报道不同，一些氮源不但没有抑制角蛋白酶活力，反而一定程度上提高了角蛋白酶的活力，如甘氨酸、半胱氨酸，促进了羽毛蛋白的降解。这可能与碳氮源的加入量有很大关系，微量的碳氮源可能对芽孢的萌发及角蛋白酶的产生有激活作用，只有当碳氮源的添加量在合适的水平，才能够促进羽毛蛋白的降解。过多或过少对其可能都产生反作用，其作用机理还需进一步探讨。目前羽毛利用率得不到提高，很大程度是因为角蛋白酶的活力太低，本研究的结果对于提高羽毛的利用率有重要的现实意义，同时对于环境保护也有一定的意义。

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