特种野猪ESR基因、FSHβ基因的多态性分析

何若钢 刘 谨 刘丁健 刘桂武 张家富 李斯丽 涂兴强 言 稳

（广西大学动物科技学院，广西南宁 530005）

特种野猪也称为杂优野猪，它是以纯种野公猪作为父本、优良瘦肉型猪或者本地猪为母本进行杂交，杂交后代再与纯种野公猪进行回交，以提高特种野猪的含野血缘，这样形成的一种野猪称为特种野猪。特种野猪具有浓郁的野味以及较高的瘦肉率，其肉质鲜美柔嫩香醇,脂肪含量低，营养丰富全面，含有很多种氨基酸以及很多种微量矿物质元素，渐渐成为当代新型的绿色食品。目前在市场上十分畅销，尤其是香港、广州、北京、上海等发达都市需求量相当大，特种野猪肉50元/kg仍然供不应求。

特种野猪是优良山林野公猪与优良瘦肉型母猪进行多次杂交后，经人工多次驯化的杂优野猪，其基因稳定，不易产生变异，后代可以长期做种繁殖而基因保持稳定。由于特种野猪是野猪与家猪的杂交产物，表现出很好的杂交优势，家猪、野猪的优点于一身,它既保持了纯种野猪肉质鲜嫩、风味鲜美、瘦肉率高、抗病力强、耐粗饲能力强、对环境的适应性好的优势，又保持了家猪生长速度快、饲料转化率高、繁殖力强的特点，并且克服了纯种野猪生长慢、体形偏小、季节性繁殖的缺点。所以养殖特种野猪已变成养殖业中的热门话题，属于国家科技部星火计划推广项目之一。从分子遗传学角度对特种野猪的优异特性进行全面研究非常必要。本研究收集了72头含50%野猪血缘的特种野母猪耳组织样品，对影响繁殖性状的主要功能基因（ESR、FSHβ）的多态性进行检测和分析，通过分子育种的手段提高特种野猪的产仔数，提高特种野猪的繁殖性能，为特种野猪遗传资源的保护和开发利用提供基础资料及科学依据。

1 材料和方法

1.1 样本采集和基因组提取

本研究共采集了72头含50%野猪血缘的特种野母猪耳组织样品。样品来自上思县殴达畜牧业有限责任公司旗下的特种野猪驯养场。耳组织样用装有70%乙醇的试管带回实验室，置于-20℃的冰箱保存备用。盐析法提取基因组DNA。

1.2 仪器和材料

蛋白酶 K，Sigma 公司；MarkerDL2000：takara 公司;2Xtaq Master Mix：北京天根生物有限公司；Taq酶、dNTP、MgCl2，MgSO4、PCRbuffer，Promega 公司；GelRed核酸凝胶染色剂：美国Biotium公司；无水乙醇、异丙醇等常规国产试剂：成都市成龙化工厂；琼脂糖：西班牙Biowest原装；琼脂糖胶回收试剂盒:北京天根生物有限公司。

1.3 引物设计

ESR和FSHβ基因的引物如表1所示。

1.4 PCR扩增

1.4.1 反应体系

反应总体积分别为 50 μl和 25 μl，包括：①ESR PCR 反应体系：2Xtaq Mastermix，25 μl；ESR 上游引物（20 μmol/l）1 μl；ESR 下游引物 (20 μmol/l)1 μl；DNA模板（20 ng/μl）1 μl；灭菌 ddH2O 22 μl。②FSHβPCR反应体系：2Xtaq Mastermix，12.5 μl；FSHβ 上游引物（20 μmol/l）0.5 μl；FSHβ 下游引物（20 μmol/l）0.5 μl；DNA 模板（20 ng/μl）0.5 μl；灭菌 ddH2O 11 μl。

表1 ESR和FSHβ基因的引物序列

1.4.2 反应程序

ESR PCR反应程序为：95℃预变性3 min；94℃变性 1 min；56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s；返回第2步，进行35个循环；72℃再延伸5 min；4℃保温。

FSHβ PCR反应程序为：95℃预变性3 min；94℃变性1 min；55℃退火45 s,72℃延伸45 s；返回第2步,进行35个循环；72℃再延伸5 min；4℃保温。

1.5 琼脂糖凝胶电泳及ESR片段的胶回收

扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳（5V/CM），在微波炉加热后加入适量的核酸染料GelRed，电泳缓冲液为1×TAE，在伯乐凝胶成像系统中成像观察并切胶、回收特异性目的片段（ESR），回收方法按照天根生化公司的胶回收试剂盒进行。将回收片段样品进行酶切分析。

1.6 PCR产物酶切

PCR酶切方法是首先取5 μl PCR产物到PCR管中，然后加入1.2 μl内切酶PvuⅡ，同时加入1 μl 10×buffer的内切酶PvuⅡ稀释液，加入12.8 μl灭菌超纯水，总共是20 μl体积，放在37℃水浴锅中水浴8 h，最后于4%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 ESR、FSHβ基因型分析

ESR基因型分析：ESR基因中B等位基因一个碱基对发生点突变，导致ESR基因座位等位基因表现出差异。这种差异产生了一个限制性内切酶PvuⅡ的酶切位点，ESR基因的PCR产物经限制性内切酶PvuⅡ酶切后呈现出多态性，根据其条带的数目和位置，确定有AA、AB、BB 3种基因型，其等位基因A的片段为121 bp，等位基因B的片段为（56+65）bp。据此，AA基因型为一条带，为121 bp，AB基因型为三条带，为 121、65、56 bp，BB 基因型为两条带，为 65 bp和56 bp。

FSHβ基因型分析：FSHβ基因中A等位基因在其第1内含子中存在1个292 bp的逆转座子插入突变,导致A、B等位基因的长度出现差异,这造成FSHβ基因座位的等位基因差异,这种差异在电泳中产生不同图谱，其等位基因A的扩增片段为500 bp,等位基因B的扩增片段为220 bp。据此也可将FSHβ基因座位分为AA，AB和BB 3种基因型，若扩增结果出现500 bp的单条带则为AA型,若出现500 bp和220 bp两条带则为AB型,若出现220 bp一条带则为BB型。

1.8 数据处理

分析所有基因图谱，整理基因型数据，计算所测特种野猪群ESR基因以及FSHβ基因中不同基因型的基因型频率、各等位基因在整个群体中出现的基因频率，用SPSS分析各基因型产仔数的差异显著性，数据用平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 ESR-PCR扩增以及酶切结果

2.1.1 ESR-PCR扩增结果

PCR扩增产物电泳图谱见图1。

2.1.2 ESR酶切结果

扩增产物经限制性内切酶Pvu Il酶切后出现多态，在图中根据条带的数目和位置，我们可以确定有AA、AB 两种基因型，分别为（AA 121 bp）；AB（3条带，65+56+121 bp）

2.2 FSHβ-PCR扩增结果

FSHβ经PCR扩增后其扩增产物于1%琼脂糖凝胶检测，电泳图谱如图4和图5。基因只表现出AA和AB两种基因型。其频率分别为91.67%和8.33%，等位基因A和B的频率分别为95.83%和4.17%，AA型以及等位基因A的频率均超过90%，在群体中占据明显的优势地位。FSHβ亚基基因表现出三种基因型AA、AB和BB，其频率分别为11.11%、55.56%以及33.33%，AB型为优势基因型。等位基因A和B的频率分别为38.89%和61.11%，等位基因B在群体中占据优势。

2.3.2 ESR、FSHβ不同基因型与产仔数关系

在被检特种野猪群体中ESR基因缺少BB型，ESR基因、FSHβ亚基基因不同基因型之间与总产仔数、产活仔数以及初生重的关系见表3。

表3 特种野猪ESR、FSHβ不同基因型与产仔数关系

2.3 统计分析结果

2.3.1 ESR、FSHβ亚基因多态在特种野猪中的分布及作用

在所检测的72头特种野猪中ESR和FSHβ亚基基因不同，基因型分布（头数）、基因型频率和基因频率见表2。

表2 特种野猪ESR和FSHβ基因的基因型频率及基因频率

从表2可以看出，在所检测的特种野猪中，ESR

由表3可知，在所检测的特种野猪群中，ESR基因中AA和AB两种基因型对应的猪总产仔数、产活仔数存在显著差异(P＜0.05)，且AB＞AA基因型，AB型比AA型的猪总产仔数、产活仔数分别高1.94头以及1.9头。不同基因型对仔猪出生重的影响差异不显著（P＞0.05）。FSHβ基因AA、AB和BB三种基因型对应的猪总产仔数和产活仔数均以BB型最高，显示出BB＞AB＞AA基因型的趋势。其中BB型对应的猪总产仔数显著高于AA型（P＜0.05），比AA型高1.33头，BB型产活仔数显著高于AA型以及AB型（P＜0.05），分别高0.85头和1.03头。

3 讨论

3.1 ESR基因多态性及其与产仔数的关联分析

在所检测的72头特种野猪中，ESR基因不同基因型猪总产仔数、产活仔数均存在AB基因型＞AA基因型，且AB型猪总产仔数、产活仔数均显著高于AA型，这表明ESR基因是控制产仔数的主基因或与产仔数主基因存在紧密连锁，而B等位基因是增加产仔数的优势基因。这与赵西彪等、丁家桐等研究结果一致。

李凤娥等、Natoloczna-Kotara对不同猪品种ESR基因进行了多态性分析，统计了ESR基因B等位基因在不同品种中的频率,结果表明：大白×梅山(0.59)、梅山猪（0.50）、中国瘦肉猪新品系 DIV2（0.68）、清平猪（0.90）、通城猪（0.67），这表明繁殖性能高的中国本地猪种含有较高优势基因B。而在本试验中特种野猪的ESR等位基因A的频率为0.958 3，在群体中占绝对优势地位，这可能是导致特种野猪产仔数偏低的主要原因。

根据试验结论推断，ESR为BB基因型的母猪产仔数应最多，但在本试验所检测的特种野猪群中ESR基因缺少BB基因型，这可能是因为等位基因B在群体中所占的基因频率太低，不容易被检测到所致。另外，样本量偏小可能也是导致没有检测到ESR基因BB基因型的一个因素。统计结果发现仔猪初生重在不同基因型之间没有显著影响，这和国内外的多数报道一致，这说明ESR对仔猪初生重不产生显著影响，只能提高母猪的产仔数。

3.2 FSHβ基因多态性及其与产仔数的关联分析

本次在特种野猪群体中对FSHβ基因多态性的检测共检测到AA、AB、BB三种基因型，虽然AB基因型总产仔数与AA、BB基因型差异未达到显著水平，AB基因型产活仔数与AA基因型差异也未达显著水平，但三种基因型总产仔数和产活仔数呈现BB＞AB＞AA的趋势，这表明对于FSHβ基因而言，等位基因B是影响产仔数的优势基因，鲁绍雄等在撤坝猪ESR和FSHβ基因多态性及其与产仔数的关联分析中得到FSHβ基因对撒坝猪产仔数的影响是FSHβ亚基基因BB型为猪产仔数增效基因型，等位基因B为产仔数增效基因；周胜花等在ESR和FSHβ基因与晋阳白猪繁殖性状关系研究中得到FSHβ基因为BB基因型的母猪产仔数最多，FSHβ基因的有利基因B频率较高，晋阳白猪高繁殖性能可能与有利基因B的频率较高有关。本研究与以上研究结果一致。

FSHβ亚基基因的多态性分析中发现国内地方猪种如莱芜黑猪、香猪、二花脸猪、民猪、撒坝猪等群体中A等位基因占优势，而在国外著名猪种中如约克夏、长白等群体中等位基因B占优势。本研究中特种野猪FSHβ亚基B基因频率占优势，为0.611 1，这与报道过的其它中国地方猪种的分布频率有很大的偏差，这可能与特种野猪在培育的过程中引入外血有关。

4 结论

在所检测的特种野猪群中，ESR基因，AB型比AA型的猪总产仔数、产活仔数分别高1.94头以及1.9头。FSHβ基因BB基因型的猪总产仔数和产活仔数最高，显示出BB＞AB＞AA基因型的趋势，其中BB型比AA型高1.33头，BB型产活仔数分别比AA、AB高0.85头和1.03头。ESR、FSHβ不同基因型对仔猪初生重的影响差异不显著。

从本次检测结果来看，被检测的特种野猪ESR基因和FSHβ基因不同基因型能对产仔数产生显著影响，因此FSHβ基因和ESR基因可以作为控制猪高繁殖率的候选基因。ESR基因能增加产仔数的优势基因B频率相当低，为0.041 7；而FSHβ基因中能增加产仔数的优势基因B的频率较高，为0.611 1。因此，对该群体来说，注意提高ESR基因中等位基因B的频率，将能显著提高猪群的繁殖性能。在以后的育种工作中，可以把具有ESR基因的B等位基因的个体予以保留，通过标记辅助选择(MAS)来改良猪产仔数性状，从而带来巨大的潜在经济效益。

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