缺氧诱导因子－1的稳定性调节＊

刘 波(综述)，石京山，龚其海(审校)

(遵义医学院药理学教研室暨贵州省基础药理重点实验室，贵州 遵义 563099)

缺氧诱导因子－1(hypoxia－inducible factor－1，HIF－1)是在研究缺氧诱导的红细胞生成素(erythropoietin，EPO)的基因表达时发现的一种DNA结合蛋白，其分布和作用十分广泛，目前已确定的靶基因已有130多种，且这些基因编码的蛋白参与血管再生与重塑、促进神经再生、葡萄糖的运输及酵解、红细胞生成、氧化应激和炎性等多种病理生理过程。本文结合国内外对HIF－1的研究报道，系统综述了HIF－1的结构及其稳定性调节。

1 HIF的结构和稳定性调节

Semenza［1］等于1992 年最先确立了 HIF －1 的组成结构，并证明了其cDNA的编码顺序。它属于PAS家族(PER－ARNT－SIM)，由120KD的氧依赖性β亚基和91/93/94KD的非氧依赖性β亚基组成的异二聚体转录因子，α和β亚单位均属于碱性螺旋 －环 －螺旋(basic helix－loop－helix，bHLH)家族。HIF－β又称芳香烃受体核转运蛋白，在细胞内稳定表达，不受氧浓度的影响。而HIF－α是决定HIF生物学活性的亚基，HIF－α表达对细胞内氧浓度高度敏感，被称为“缺氧基因表达的总开关”。在常氧条件下，HIF－lα的表达与降解处于动态平衡，只有5 min的极短的半衰期，细胞内的HIF－1α表达后，脯氨酸羟化酶(proline hydroxylase，PHD)立即加载到HIF－1α亚基氧依赖降解区(oxygen－dependent degradation domain，ODD区)Pro402或Pro564上，形成脯氨酰残基。羟化后的脯氨酸残基能够敏感的结合到VCBCUL复合物上，依赖E3泛素蛋白酶体途径降解。所以常氧时HIF的含量低于可检测水平。同时天冬氨酰羟化酶，即缺氧诱导因子抑制因子(factorinhibiting HIF，FIH)与 C－TAD区的天门冬酰胺803(Asn803)结合，阻碍其Asn803与转录辅助激活因子P300/CBP结合，抑制HIF－lα转录活性。氧浓度下降时(氧浓度≤8% ～10%)，HIF－1α亚基ODD结构域脯氨酸的羟基化被抑制，HIF－1α的泛素化降解受阻，促使HlF－1α在胞浆内积聚。同时Asn803与转录辅助激活因子P300/CBP顺利结合，共同形成大分子复合物，提高了HIF－Iα转录水平。胞浆内大量积聚的HIF－1α将移位至胞核，与HIF－1β形成异源二聚体，在转录辅助激活因子参与下，促进HIF－1异源二聚体与靶基因的缺氧反应元件(hypoxia response element，HRE)结构域结合引起靶基因的转录，使细胞对缺氧产生一系列的适应性反应。

如图1所示。现已表明缺氧导致HIF－1活性至少受其mRNA转录、蛋白质水平和HIF－1二聚化等三个水平的调节，其中最主要受其蛋白质水平调节，即通过HIF－1蛋白的羟化、磷酸化、乙酰化的调节及其信号转导途径而提高蛋白质的稳定性，增强转录活性［2］。

1.1 氧依赖调节

图1 HIF在常氧与缺氧时的稳定性调节

1.1.1 羟基化修饰 HIF羟基化修饰需要一类重要的酶—PHD，PHD是 Fe2+、α－酮戊二酸依赖的双加氧酶超家族成员，脯氨酸羟化酶羟基化物需要O2作为底物，这是实现氧分压感知功能的关键。当氧气足够时PHDs以氧分子为底物，其中一个氧原子加载到HIF－1ODD区Pro402或 Pro564形成脯氨酰残基［3］，PHD羟基化同时需要以铁和维生素C作为辅助因子，脯氨酸残基羟化后与HIF－1β及林希病肿瘤因子(product of Von Hippel－Lindau disease，pVHL)的亲合力增强，pVHL是 E3泛素蛋白连接酶复合体的组分，又是泛素依赖蛋白酶降解的靶蛋白，HIF羟基化后产物能敏感的结合到pVHL－E3(VCB－Cul)复合物上，从而进一步引起HIF的降解;另一个氧原子则与α－酮戊二酸发生去碳羧基反应，生成延胡索酸和二氧化碳。由于Fe2+或 Co2+可以与HIF－1ODDD脯氨酸羟化位点结合，从而可封闭与PHD结合的位点，致使HIF－1稳定存在，因此铁螯合剂 (如去铁胺)和竞争剂(如 CoCl2)可以模拟低氧反应，上调细胞内HIF－1的表达［4］。现已证明 PHD有3种亚基，其 C端催化区高度同源，N端则明显不同，即均具有催化HIF－α特定脯氨酸残基羟基化的活性，但在亚细胞定位、底物选择性、组织分布等方面有显著差异。(见表 1)［5］。

表1 PHD各亚基的特点

HIF－1的调控不仅受到脯氨酸羟化酶的支配，同时受到缺氧抑制因子—FIH的支配。无论在胞核或胞浆中，常氧下，FIH－1能对 HIF－1的Asn803进行羟基化修饰，导致HIF－1失去与转录共激活因子的富集功能从而丧失转录活性。而缺氧时，FIH－1的催化功能受到抑制，HIF－1便能够与特定的转录共激活基因P300/CBP形成有功能的转录复合体，再通过结合靶基因上的HRE启动基因的表达，如血管内皮生长因子、促红细胞生成素、葡萄糖转运蛋白、糖酵解酶等。PHD与FIH调控HIF－1的作用分别相当于粗调和精调的关系［6，7］。

1.1.2 乙酰转移酶与乙酰化修饰 HIF－1可被乙酰转移酶(arrest defective 1，ARD1)催化经乙酰化修饰，且修饰后更易与pVHL结合。HIF－1的ODD区中第532位的赖氨酸即Lys532可被ARD1乙酰化。ARD1为酵母与N－乙酰转移酶(一种低等真核细胞蛋白)的同系物，其作用与脯氨酸羟化酶类似。HIF－1乙酰化后与pVHL的结合能力明显增强，使HIF－1经蛋白酶复合体途径降解。参与调控组蛋白乙酰化的关键酶有两种:组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)和组蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases，HATs)，二者的动态平衡决定组蛋白的乙酰化程度，同时HATs/HDACs也可间接调控基因的活化和沉默，且HIF－1的乙酰化修饰也可被 HATs和HDACs可逆调控。当HIF－1的 Lys532突变为精氨酸后，HIF－1的稳定性将明显增高［8］。HDACs能够抑制HIF－1的转录活性。已经证实，HDACsIII家族成员Sirt1能够使 HIF－1去乙酰化，并抑制其活性［9］。Laemmle A等研究表明，缺氧时Sirt1可以使HIF－1蛋白积聚，促使HIF－1靶基因的激活［10］。HDAC1和HDAC3对HIF－1α稳定性的正调节可能通过两者的相互作用，其在HIF－1诱导的肿瘤血管发生中起了重要的作用［11］。目前，更多的研究主要集中于HDACs抑制剂(histonedeacetylase inhibitor，HDACIs)，它可抑制去乙酰化的发生，进而通过提高多种转录因子和转录辅助因子的乙酰化水平，促进这些基因的表达。将HADCIs作用于大多数肿瘤细胞，结果发现HIF－1的稳定性明显降低，因此可以推断，HADCIs可能通过抑制去乙酰化的发生而维持HIF－1的乙酰化水平，加快HIF－1通过泛素－蛋白酶途径发生降解［12］。

1.1.3 SUMO与可逆性 SUMO化修饰 SUMO化是一个动态的过程，可由SUMO－特定的酶催化逆转。缺氧能够诱导HIF－1的SUMO化，通过结合pVHL，再经过泛素酶降解，研究表明SENP1在缺氧时调节HIF－1的稳定性起着关键的作用，SUMOylation可作为泛素依赖降解的一个直接的信号［13］。在内分泌相关肿瘤组织中，Shan［14］等报导了RWD区域，RWD区包含SUMO增强子，它在人体的垂体腺瘤中表达，在缺氧时，调节HIF－1引起血管内皮生长因子的表达起着尤为重要作用。缺氧时，延髓头端腹外侧HIF－1的SUMO化，对实验性脑死亡时对脑干血液流量起着调节作用［15］。Shao等［16］发现在低氧状态下，SUMO表达增加，细胞核内HIF－1水平也明显增加，故认为SUMO可能对HIF－1起到促进或保护作用。同时，低氧环境下，一种叫做RSUME的蛋白表达应激性也增高，可促进SUMO表达及HIF－1的SUMO化［17］。以上研究提示，低氧时SUMO修饰HIF－1可提高HIF－1稳定性。目前就SUMO修饰HIF－1的效果而言尚存争议，Me’lanie A等［18］通过离体实验发现HIF－1受SUMO负性调控。还有研究表明SUMO分子也可以共价结合HIF－1βPAS区的Lys245，可能HIF－1的活性会受到抑制［19］。此外，Cheng等［20］研究表明，不同细胞在低氧状态下差别较大，并且HIF和SUMO的作用位点和结合能力会受实验条件影响。因此对于HIF－1的SUMO化修饰的机制还需进一步补充。

1.2 非氧依赖调节 除依赖氧浓度调节，HIF－1同时受到磷酸化修饰、生长因子、细胞因子等非氧因素的调节。

1.2.1 PHD抑制剂 PHD抑制剂预处理或通过其他方法抑制PHD蛋白能够使HIF－1积聚，可对脑中风损伤起到保护作用［21］。研究表明分别给予75%的CoCl2或56%去铁草酰胺可诱导HIF－1对中风产生保护作用［22］。亚铁离子是PHD的辅酶，PHD有上的两个组氨酸和一个羧酸盐残基是亚铁离子的结合部位，由于亚铁离子与PHD结合不牢固，镉和镍等金属离子可取代亚铁离子与PHD结合，抑制PHD对HIF－1的羟化作用，阻断HIF－1降解途径，使HIF－1在常氧条件下保持稳定［23］。最近研究表明可通过PHD的抑制剂DMOG上调eNOS的水平，从而诱导HIF－1α产生，保护永久性或短暂性脑缺血后的神经细胞［24］。

1.2.2 磷酸化修饰 HIF－1是一种磷酸化蛋白，HIF－1α的磷酸化位点是苏氨酸796(Thr796)。磷酸化过程可改变蛋白合成过程中蛋白本身的合成与降解，进而影响HIF－1亚单位表达，实现其稳定性调节。现有研究表明，Ser/Thr激酶抑制剂及酪氨酸激酶抑制剂均可降低HIF－1稳定性。同时，缺氧诱导的磷酸化作用也可增强HIF－1的转录活性［25］。

1.2.3 信号转导途径 在常氧状态下，亚砷酸盐可激活PI3K/Akt通路，进而诱导HIF－1α蛋白表达，增强HIF－1基因转录活性。同时，应激也可通过PI3K/Akt/mTOR途径诱导HIF－1在大鼠心肌表达，从而促进VEGF表达［26］。此外，一些生长因子和细胞因子也可经PI3K途径激活HIF－1，如胰岛素可激活Akt增加HIF－1α蛋白表达及HIF－1的DNA结合活性。胰岛素样生长因子－1(insulin－like growth factor 1，IGF－1)可以通过PI3K/Akt/mTOR激活HIF－1的转录蛋白，从而引起葡萄糖载体3(GLUT3)的高表达［27］。IGF－1可增加UCT116细胞 HIF－1α蛋白表达，而 LY294002(PI3K抑制剂)可抑制其对 HIF－1α的诱导［28］。PI3K抑制剂Ly294002、wortmannin或 mTOR抑制剂雷帕霉素可抑制表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、血管紧张素 II(angiotensin II，Ang II)诱导 HIF－1α 蛋白表达及 VEGF 转录激活［29，30］。在正常组织或癌症组织中通过PI3K/Akt/mTOR激活HIF－1α氧依赖性调节和非氧依赖性调节，可引起VEGF的表达增加，引起血管发生［31］。研究表明，常氧状态下PI3K/Akt/mTOR对HIF－1α的诱导与缺氧对HIF－1α的诱导有所不同，其机制可能不是通过抑制HIF－1α的降解实现，而是通过增加 HIF －1α 的蛋白合成［32］。Zhou 等［33］研究表明PI3K/Akt可促进热休克蛋白表达，而热休克蛋白又可抑制常氧时HIF－1α蛋白的降解。当然，常氧状态下PI3K/Akt/mTOR对HIF－1α的准确调控机制仍需进一步研究。

还有文献报道，ROS可能参与了HIF－1的非氧分压因素调节［34］。ROS通过脯氨酸羟化酶、PKB和MAPK等对HIF进行调节。ROS对HIF－1的稳定性调节机制尚不明确，它可能是由于能激活PHD提供氧，负责HIF－1的降解［35］。也有可能是能促使HIF－1α被氧化，而更易于经泛素系统降解［36］。除这些途径和因子外，环境刺激及其他信号分子也可在低氧时与相应的酪氨酸激酶受体结合，并激活磷脂酰肌醇－3激酶，最终促进HIF－1的表达。

2 展望

近几年对HIF－1的调控系统研究取得迅速进展，但有一些调节机制还不是很明确。随着对HIF－1研究的不断深入，其功能更多地被认识，对其结构和调节机制的进一步研究将为临床上多种疾病的发病机制如缺血性脑损伤及其治疗提供新的思路。

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