荧光定量PCR技术的原理与应用

王志平

(1渭南师范学院化学与生命科学学院，陕西渭南714000;2陕西省多河流湿地生态环境重点实验室，陕西渭南714000)

聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术是一项DNA体外扩增技术，主要应用于特异性基因的检测以及生物鉴定等方面.1983年PCR技术发明以来，生物技术迅猛发展.早期的PCR定量方法都是基于产物的终点浓度测定，20世纪90年代实时(real-time)PCR的发明推动了PCR定量技术的发展与应用［1－2］.荧光定量PCR是在普通PCR技术基础上建立的一种核酸定量技术，即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累对整个PCR进程进行实时监测，并根据标准曲线对未知模板进行定量.目前，该技术已广泛应用于疾病诊断、食品检测、环境监测以及分子生物学研究等领域，而且其应用范围仍在不断拓展.

1 荧光定量PCR技术原理

在荧光定量PCR反应体系中加入一种荧光化学物质，目前，最常用的是SYBR GreenⅠ染料，它能与双链DNA小沟部位结合，而且具有绿色激发波长.在PCR进程的复制和延伸阶段，该染料插入DNA双链中发出荧光，在变性阶段，由于DNA双链解开，染料从DNA分子上游离下来而不产生荧光，因此荧光信号的强弱与双链DNA的量成正比.PCR进程中，随着产物的积累，荧光信号的强度等比加强.每经过一次循环，收集一次荧光信号，即可得到一个荧光扩增曲线(图1)，根据荧光强度的变化即可监测产物量的变化.

通常，荧光扩增曲线可分为三个阶段，即荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期.在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此可以在该阶段进行定量分析.为了便于对所检测样本进行比较，在指数期需要设定一个荧光信号的阈值.检测到的荧光信号超过阈值则被认为是真正的信号.荧光信号由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数称为Ct值.模板的Ct值与其起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，则Ct值越小(图2).利用已知起始拷贝数的标准品及其相应的Ct值可绘制出标准曲线，测得未知样品的Ct值后，根据标准曲线便可准确计算出该样品的起始拷贝数.

2 荧光定量PCR技术的应用

定量PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，有效解决了PCR污染和定量不准确等问题.首先，该技术特异性强、灵敏度高，可以对小于5拷贝的靶基因序列进行定量分析，也可以对表达差异极其微小的基因进行比较分析;其次，该技术定量准确，整个过程在全封闭的容器中进行反应，不需要对产物进行染色以及电泳检测等后续操作，极大地降低了交叉污染的可能性;另外，该技术简便快速高效，便于高通量自动分析［3］，已成为科学研究与生产实践的重要工具之一.

图2 模板量与Ct值的关系

2.1 在疾病诊断与治疗中的应用

在疾病诊断中，样品内病原体达到一定数量才具有临床意义，因此必须对样品中的病原体进行定量才能作为诊断依据，并为药物治疗以及后续观察提供参考.传统PCR技术及凝胶电泳在病原体的定性检测中具有较高灵敏度，然而却不能实现病原体的准确定量.相比之下，定量PCR技术在疾病诊断与治疗的应用却逐步得到了推广.目前，荧光定量PCR技术已成功应用于人类乳头瘤病毒、肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒等，以及结核杆菌、支原体、衣原体等多中病原体的检测研究［4］.例如，Kessler等发现利用定量PCR技术可以对乙型肝炎病毒感染的不同程度进行鉴定，从而为后续治疗提供参考依据［5］.

癌基因在致癌因子作用下表达增加或突变通常是在肿瘤发生早期和良性阶段，导致肿瘤很难被及时诊断与治疗.荧光定量PCR技术的发展与应用则能够有效解决这一技术难题，它不但能够有效检测癌基因的突变，而且能够对癌基因的表达水平进行准确定量，从而用于肿瘤的早期诊断、分型、分期以及预后判断.例如，Ferrari等发现可以将癌基因在盆腔淋巴结中的表达情况作为前列腺癌治疗的预后标志，对肿瘤转移情况进行分析［6］.另外，利用该技术可观测用药前后及复发时肿瘤细胞中耐药基因的表达变化，为研究肿瘤耐药、指导临床治疗提供有效途径［7］.

荧光定量PCR技术在兽医研究中也得到越来越广泛的应用.例如，关于猫冠状病毒和莱姆病等多种病原体的荧光定量PCR检测方法均已建立.有研究表明，用定量PCR能够快速灵敏地检测鸡传染性支气管炎病毒［8］，牛伟等建立了定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的荧光定量PCR方法［9］，从而为相关疾病的诊断与治疗提供有效依据.

在新药开发的研究过程中，荧光定量PCR技术可以快速了解药物对疾病进程的影响，为新药开发节约大量的人力、时间和资金.

2.2 在食品检测方面的应用

目前，荧光定量PCR技术已广泛应用于食源微生物、食品过敏源、转基因食品以及动物源性食品的检测等方面.邵彪等发现利用多重荧光定量PCR可以在同一反应体系下同时对食品中多种污染菌进行准确快速的检测［10］.在食品发酵过程中，利用荧光定量PCR技术可以直接检测发酵产物中的微生物种群，而不需要培养活菌，因此可以缩短检测程序，提高检测效率.

在转基因食品检测方面，裘劼人等验证了利用荧光定量PCR技术检测转基因植物中外源基因拷贝数的可行性［11］.Muleg等利用该技术检测葡萄中曲霉菌的污染程度［12］.日本和美国等13个实验室运用荧光定量PCR技术对转基因玉米和转基因大豆进行了定量研究，结果表明，荧光定量PCR技术可以应用于转基因作物标识制度的实际检测［13］.

2.3 在环境监测方面的应用

环境中存在许多致病微生物，它们与疾病传播密切相关.因此，定期检测环境中致病微生物的种类、数量及其变化趋势对于传染病的预防和控制具有重要意义.与传统的环境微生物病原体检测方法相比，荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、快速简便等优点.Brooks等的研究表明，定量PCR技术对甲肝病毒的定性及定量测定均有很高的精确度［14］.Rebecca等建立了利用定量PCR技术对易引起水传播疾病的贾第虫和隐孢子虫进行定量分析的方法［15］.李伟等建立了应用荧光PCR技术定量检测土壤和脏器中炭疽芽孢杆菌的方法［16］.Grtintzig等利用荧光定量PCR技术检测环境样品中功能基因(反硝化亚硝酸盐还原酶基因)的丰度，进而分析不同环境中施氏假单胞菌的丰度［17］.何闪英和吴小刚建立了定量检测赤潮生物圆海链藻的实时定量PCR方法，为赤潮研究提供了有效的检测技术［18］.

此外，利用荧光定量PCR技术还可以定量研究微生物的种类组成及数量变化，进而深入探索微生物群落与环境因子之间的相互作用及其动态变化过程，为预测不同环境条件下微生物种类组成与数量变化趋势提供依据，进而为传染病的预防和控制提供参考.例如，Tay和Hemond利用定量PCR技术检测了两种甲苯降解菌自养黄色杆菌和分支杆菌在污染区和非污染区的数量分布情况以及两种微生物数量的季节性变动［19］.

2.4 在遗传学和分子生物学研究中的应用

在遗传学研究中，利用荧光定量PCR技术可以进行点突变分析、突变基因检测、等位基因分析、DNA甲基化检测以及单核苷酸多态性分析等方面的研究.例如，利用荧光定量PCR并结合相关测序方法，可以对已知DNA序列的突变基因和序列多态性进行定位，也可通过扩增DNA限制性位点的方法来检测遗传变异.Bjerre等利用定量PCR技术进行了单核苷酸多态性和基因突变方面的研究［20］.若在扩增之前对DNA进行处理，然后用特异的引物和探针可以区分甲基化和非甲基化的DNA，从而研究不同处理对DNA结构的影响.另有研究表明，利用荧光定量PCR技术还可以有效鉴定杂合子和纯合子［21］.

在分子生物学研究中，荧光定量PCR技术主要用于基因表达研究.应用荧光定量PCR技术可对mRNA表达水平和动态变化进行研究，例如mRNA的直接定量分析、突变等位基因检测、mRNA剪接变异体的检测等，其中，在定量mRNA表达水平的研究中应用最为普遍.此外，该方法还用于细胞凋亡的研究.例如，路钊等运用该技术研究了BATF2/SARI转录因子诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制［22］.

2.5 在法医鉴定中的应用

目前，荧光定量PCR技术在法医上主要应用于亲子鉴定和个人识别，从血痕、精斑、毛发、骨或其他组织中提取DNA后，通过DNA分型或DNA指纹可以进行亲子鉴定或个人识别，从而为案例侦破提供有效的法律依据.

3 结语

荧光定量PCR技术是近年发展起来的一种新的DNA定量检测方法，可以弥补普通PCR的许多不足，在传统医学、食品检验、环境监测及生物学研究等领域的应用逐步得到推广.随着荧光定量PCR技术的不断改进和完善，它将在基础研究领域和生产实践中发挥出更大的应用价值.

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