巴西蘑菇液体摇瓶培养基和培养条件的优化

聂建军，李彩萍，杨玉画，李兆斌

（1.山西省农业科学院农业资源与经济研究所，山西 太原 030006；2.山西省农业科学院农业环境与资源研究所，山西 太原 030006）

巴西蘑菇（Agaricus blazei Murrill），又名姬松茸、柏氏蘑菇、小松菇，属真菌门（Eumycota）、担子菌亚门（Basidiomycotina）、层菌纲（Hymenomycetes），伞菌目（A－garicales）、蘑菇科 （Agaricaceae）、蘑菇属 （Agaricus）。

巴西蘑菇原产于巴西和秘鲁，日本人首先引种栽培成功，将它取名为“姬松茸”。巴西蘑菇营养丰富，所含多糖、糖蛋白复合体、甾醇类物质具有提高机体免疫力、抗癌、抗病毒等功效，尤其多糖含量高于一般的食用菌，抗肿瘤活性远高于灵芝，且口服效果不逊于注射，被日本医学界称为“地球上肿瘤患者最后的食品”。巴西蘑菇产品市场价格始终居高不下，是一种极具开发价值的珍贵食药用菌。但是，巴西蘑菇的子实体培养很困难，产量非常有限，远不能满足市场的需求，所以采用液体深层培养的方法大规模生产巴西蘑菇菌丝体及其发酵液，开发出各种相关产品，具有很大的市场潜力[1-4]。本项研究对巴西蘑菇液体摇瓶培养基和培养条件进行了优化，旨在为把液体摇瓶培养的菌丝体作为中间过渡菌种而进一步扩大深层培养奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

巴西蘑菇（Agaricus blazei Murrill）MH1菌株，由山西省农科院食用菌研究所提供。

1.2 供试培养基

1.2.1 母种培养基

采用马铃薯琼脂培养基（PDA）培养基。

1.2.2 碳源基础培养基

蛋白胨0.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%，pH值自然。

1.2.3 氮源基础培养基

葡萄糖2%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%，pH值自然。

1.2.4 试验培养基

将葡萄糖、蔗糖、玉米粉、乳糖、甘露醇和山梨糖分别加入碳源基础培养基中（浓度均为2%），进行碳源优化试验；将蛋白胨、酵母膏、硝酸铵、尿素、豆饼粉和麸皮分别加入氮源基础培养基中（浓度均为0.5%），进行氮源优化试验。

1.2.5 优化培养基

根据1.2.4中碳、氮源单因素试验结果，选择较好的碳、氮源各2个，进行L9(34)正交试验[5]。以葡萄糖（A）和玉米粉（B） 为复合碳源，酵母膏（C） 和豆饼粉（D）为复合氮源，采用4因素3水平正交试验方法，筛选出巴西蘑菇液体摇瓶最佳培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化与纯化培养

将巴西蘑菇菌种从冰箱中取出后，25℃下恒温放置7 d，使处于低温中的菌种活化；无菌条件下把活化菌种接种于马铃薯琼脂培养基平板上，28℃下恒温培养3 d~4 d，之后挑取强壮菌丝体前端，接种于斜面培养基上，28℃下恒温培养至斜面长满，得一级菌种备用。

1.3.2 碳 (氮)源筛选试验

取3块0.5 cm2巴西蘑菇一级菌种，分别接种于不同碳（氮）源培养基中，500 mL三角瓶装液体培养基100 mL，使气生菌丝一面向上悬浮，25℃下静置24 h；然后放入往复式摇床内，25℃，150 r·min-1条件下培养7 d。每种碳（氮）源试验重复5次，结果取平均值。

1.3.3 培养基筛选

把巴西蘑菇一级菌种分别接入不同的正交试验培养基中，培养条件同1.3.2，筛选出最佳培养基配方。试验因素及其各水平如表1所示。

表1 培养基正交试验的因素及水平

1.3.4 培养条件筛选

以筛选出的培养基为培养基。一级摇瓶500 mL三角瓶装100 mL培养基，培养条件同1.3.2；在160 r·min-1的转速下，二级摇瓶500 mL三角瓶的装液量、接种量、培养温度、培养天数按正交试验处理。试验因素及其各水平如表2所示。

表2 培养条件正交试验的因素及水平

1.4 测定方法

1.4.1 菌球密度的测定

用吸管吸取1 mL培养液在玻璃板上摊成薄薄的1层，用接种针将菌球分开，进行直观计数，如此重复5次，取其平均值。

1.4.2 菌球直径的测定

随机取菌球30个，排列成直线，并测其总长度，求得菌球的平均直径。

1.4.3 生物量的测定

取培养好的菌丝体液在3 000 r·min-1的条件下离心10 min，蒸馏水洗涤，再离心，倒去上清液，菌丝体在60℃下烘干至恒重，称量。

2 结果与分析

2.1 碳源筛选试验结果

碳源筛选试验结果见表3。

表3 不同碳源对巴西蘑菇菌丝体生长的影响

从表3可以看出，葡萄糖作为碳源，其平均菌丝体生物量最高，达12.28 g·L-1；平均菌球密度最大，约为223个·mL-1；平均菌球直径较小，为1.68 mm。综合比较，葡萄糖作为巴西蘑菇液体摇瓶培养基碳源效果最佳，其次是玉米粉、蔗糖等。

2.2 氮源筛选试验结果

氮源筛选试验结果见表4。

表4 不同氮源对巴西蘑菇菌丝体生长的影响

从表4可以看出，酵母膏作为氮源，其平均菌丝体生物量最高，达13.32 g·L－1；平均菌球密度较大，为228个·mL－1；平均菌球直径较大，为1.81 mm。综合比较，酵母膏作为巴西蘑菇液体摇瓶培养基氮源效果最佳，其次是豆饼粉、蛋白胨等。

2.3 正交试验优化巴西蘑菇液体摇瓶培养基结果

L9(34)正交试验结果与极差分析结果见表5。

表5 培养基配方正交试验结果

从表5可以得出，影响巴西蘑菇菌丝体生物量的因素依次为A＞C＞D＞B，即葡萄糖＞酵母膏＞豆饼粉＞玉米粉；巴西蘑菇液体摇瓶最佳培养基组合为A2B2C3D2，即葡萄糖2%、玉米粉2%、酵母膏0.75%、豆饼粉2%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%。

2.4 正交试验优化巴西蘑菇液体摇瓶培养条件结果

L9(34)正交试验结果与极差分析见表6。

从表6可以得出，影响巴西蘑菇菌丝体生物量的因素依次为D＞C＞B＞A，即接种量＞装液量＞培养天数＞培养温度；巴西蘑菇液体摇瓶最佳培养条件为A3B2C3D3，即培养温度28℃，8 d，装液量150 mL，接种量15%。

3 结论

通过筛选试验发现，巴西蘑菇液体摇瓶培养基最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母膏。培养基中的玉米粉和豆饼粉来源广泛、价格低廉、营养丰富，可以显著降低生产成本，是大规模生产巴西蘑菇液体菌种的最佳原料。

表6 培养条件正交试验结果

采用正交试验方法筛选巴西蘑菇液体摇瓶培养基配方，结果表明，巴西蘑菇液体摇瓶最佳培养基为葡萄糖2%、玉米粉 2%、酵母膏0.75%、豆饼粉2%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%，最佳培养条件为装液量每500 mL装150 mL，接种量 15%，转速 160 r·min－1，培养温度 28℃，8 d。

摇瓶的装液量和摇床的转速决定了培养液溶氧量的大小。本试验是在设定摇瓶转速而改变装液量的前提下优化出了最佳培养条件，但转速是否最佳，对产生的巴西蘑菇菌丝体生物量是否有影响，有待进一步研究。

[1]隅谷立光，黄年来.巴西蘑菇[J].中国食用菌，2001，20(2)：6－7.

[2]陈智毅，李清兵.巴西蘑菇的食疗价值[J].中国食用菌，2002，20(4)：4－6.

[3]Iwade T,Ito H.Miracle Himenmatsutake[M].Tokyo:Chikyu－sha,1982.

[4]张胜友.新法栽培巴西蘑菇[M].武汉：华中科技大学出版社，2010.

[5]杜荣骞.生物统计学[M].北京：高等教育出版社，2003.