柠檬黄蜡伞的抑菌活性及石油醚层成分分析

高文彬，张雅梅，宋学洲，田 野，程 鸿，包海鹰*

（1.吉林农业大学中药材学院菌物研究所，吉林 长春 130118；2.吉林大学植物科学学院，吉林 长春 130062）

柠檬黄蜡伞 （Hygrophorus lucorum Kalchbr）[1]，别名柠檬蜡伞[2]，俗称黄油蘑[3]、小黄蘑，属真菌门（Eumycota）、担 子 菌 亚 门 （Basidiomycotina）、层 菌 纲 （Hymenomycetes）、伞菌目 （Agaricales）、蜡伞科 （Hygrophoraeae）。柠檬黄蜡伞群生或散生于针叶林或针阔混交林地上，在吉林省长白山地区[4]、燕山地区[5]和内蒙古阿尔山地区[6]广为分布。该菌味道好，干品色泽金黄，民间多用干品炖鸡来滋补身体。柠檬黄蜡伞化学成分国内外均未见报道，生理活性也只有抗氧化活性的报道[5]。对柠檬黄蜡伞子实体提取物的抑菌活性以及石油醚层化学成分进行研究，证明其可以代谢产生具有抗菌作用的活性成分，为下一步的活性化合物研究以及合理开发利用这一天然菌物资源提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药材

柠檬黄蜡伞子实体（干品） 购自阿尔山地区（2010年产）；经吉林农业大学，菌物研究所图力古尔老师鉴定为柠檬黄蜡伞（Hygrophorus lucorum Kalchbr）。

1.1.2 供试菌种

金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、沙门氏菌（Salmonella enterica）、链球菌 （Streptococcus）、大肠杆菌(Escherichia coli)，以上菌种由吉林大学畜牧兽医学院惠赠。玉米灰斑病菌（Cercospora zeae-maydis）、玉米纹枯病菌（Rhizopus spp.）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、柑橘炭疽病菌（Colletotrichum gloeosparioides）、甘薯黑斑病菌 （Ceratocystis fimbriata）、葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）、苹果腐烂病菌（Valsa mali）、禾镰刀菌（Fusarium graminearum）由吉林大学植物科学学院惠赠。

1.1.3 供试阳性药

阿米卡星注射液，批号110905，石药集团欧意药业有限公司；硫酸庆大霉素注射液，批号110902，石药集团欧意药业有限公司；氯霉素注射液，批号1106092，北京双鹤药业股份有限公司；头孢曲松钠注射液，批号110432076，苏州东瑞制药有限公司；硝酸咪康唑乳膏，批号110404j，深圳三九药业。以上药品均购自长春市吉林大药房。

1.1.4 试剂

环己烷，分析纯，汕头市西陇化工有限公司；石油醚（30℃~60℃）、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇，分析纯，天津化学试剂有限公司。

1.1.5 培养基

LB培养基（酵母粉0.5%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%，pH为7.4）；LBA培养基（酵母粉0.5%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂1.8%，pH为7.4）；PDA培养基（马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%）。

1.1.6 菌株培养

细菌无菌条件下，以移液枪吸取0.01 mL菌种于LB培养基内，密封并轻轻摇匀，置37℃摇床（转速200r·min-1）中培养10 h~18 h。真菌无菌条件下，将菌种接在PDA培养基的培养皿上，封口，置28℃恒温培养箱中培养48 h~96 h。

1.1.7 设备

气质联用仪为Agilent6890N型GC和Agilent5973IMSD型MS并配有NIST5图谱系统；Finnigan-MAT.LCQ型的电喷雾质谱仪；BrukerAM-400LBz型核磁共振波谱仪；二氧化碳细胞培养箱，HH·CP-01W；冻干机，FDU-1200。

1.2 柠檬黄蜡伞提取物的制备

将柠檬黄蜡伞实体3 000 g，25℃烘干，粉碎，甲醇室温提取3次，每次12 h，每小时搅拌1次，合并提取液，减压浓缩得到提取物，加水悬浮，分别用石油醚（60℃~90℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，萃取液减压浓缩得到各部分萃取物，低温保存。

1.3 受试样品的制备

取各提取物，冻干机冷冻干燥，密封，低温保存。用前倍半法稀释：50 mg·mL-1、25 mg·mL-1、12.5 mg·mL-1、6.25 mg·mL-1、3.025 mg·mL-1、1.5125 mg·mL-1；空白组：相应的溶剂。

1.4 供试阳性药的制备

硫酸阿米卡星注射液（1.0 mg·mL-1）：无菌条件下，精确吸取硫酸阿米卡星注射液1.0 mL于100 mL无菌容量瓶中，以pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液溶解并定容。密封后冷藏保存。庆大霉素（1.0 mg·mL-1）：无菌条件下，精确吸取硫酸庆大霉素注射液1.0 mL于200 mL无菌容量瓶中，以pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液溶解并定容。氯霉素（1.00 mg·mL-1）：无菌条件下，精确吸取氯霉素注射液0.8 mL于100 mL无菌容量瓶中，以pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液溶解并定容。密封后冷藏保存。头孢曲松钠（1.0 mg·mL-1）：无菌条件下，精确称取注射用头孢曲松钠0.1 g于100 mL无菌容量瓶中，以pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液溶解并定容。密封后冷藏保存。

1.5 抑菌试验

采用纸片扩散法测定[7]，无菌条件下，取直径为7.0 mm的圆形滤纸片蘸取供试溶液（完全浸透且无液滴滴落），在超净工作台中吹干后将该滤纸片均匀摆放在涂有细菌菌悬液的培养基上，每个培养皿中均匀摆放6个纸片，分别为供试药、阳性药和阴性对照，重复3次。置于37℃培养箱中培养16 h~18 h后，采用十字交叉法测量抑菌直径。真菌是在无菌条件下用7.0 mm打孔器将长满菌丝体的培养皿打孔，将菌饼接到PDA培养基上每个培养皿中均匀摆放4个纸片是供试药，重复3次，置于28℃培养箱中培养48 h~72 h后，采用十字交叉法测量抑菌直径。

1.6 最低抑菌浓度（MIC） 测定

采用试管二倍稀释法测定[8]，使用LB液体培养基（2 mL·管-1）将药物对倍稀释成系列浓度，每个浓度3个复管，然后加入0.1 mL菌液。在37℃培养箱中培养24 h，以混浊度为指标检查该管中有无细菌生长，眼观选出不显示混浊试管，分别取其液体涂布于琼脂平板培养基上，于恒温培养箱培养37℃，24 h，观察结果。琼脂平板上无细菌生长而含药液浓度最低者，即为该种药物对该菌株的最低抑菌浓度。

1.7 结果计算

以抑菌圈直径（mm）、抑菌率（%） 来评定药物的抑菌作用。抑菌率（P）的计算公式如下[8]：

式中：R1表示供试样品抑菌圈直径；R2表示滤纸片直径；R3表示阳性药抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 阳性药的筛选

根据实验需要，阳性药的抑菌圈直径不宜过大，否则抑菌圈会覆盖至相邻纸片上，或者2个相邻抑菌圈相连，从而影响测量准确度；阳性药抑菌圈直径过小，则会影响实验时的准确度，使误差变大。结果见表1。

表1 不同阳性药的抑菌圈直径

结果显示，金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、大肠杆菌的最佳阳性药为阿米卡星（1.00 mg·mL-1）。

2.2 柠檬黄蜡伞子实体提取物的抑菌作用

柠檬黄蜡伞子实体提取物的抑菌结果见表2。

柠檬黄蜡伞石油醚相、乙酸乙酯相对所选9种真菌均无明显抑制作用，对4种细菌沙门氏菌、链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有较好的抑制作用，正丁醇层和水层均无效果，乙酸乙酯层提取物的抑制作用最好，在浓度是50 mg·mL-1时抑菌率最高，分别是55.08%、42.97%、61.10%和50.08%（表2）。石油醚层提取物对4种菌的MIC 值分别为 3.125 mg·mL-1、6.25 mg·mL-1、3.125 mg·mL-1和3.125 mg·mL-1。乙酸乙酯层提取物对4种菌的MIC值均为 3.125 mg·mL-1。

表2 柠檬黄蜡伞子实体提取物对的抑菌效应

2.3 柠檬黄蜡伞石油醚层化学成分

石油醚层的GC-MS分析，其GC-MS总离子流色谱图如图1所示。采用WIKEY.L图谱检索，并结合质谱图中基峰、负荷比以及相对丰度与标准谱图的比较，在石油醚层中鉴定出个5化合物，结果见表3。

图1 柠檬黄蜡伞挥发油GC-MS总离子流图

3 讨论

近年来，从真菌中发现了大量结构新颖且具有生理活性的物质，根据真菌的生理特性，不仅可以直接利用子实体，而且还可以利用菌丝体或孢子进行发酵培养大量繁殖。这对于现代药物、食品防腐以及农药先导化合物的发现和工业化生产至关重要。我国真菌资源丰富，许多学者对这一资源进行考察发掘，一些新的有药用价值的真菌已被进行深入地研究并投入生产，但是从总体上来说该学科发展还是较慢，直至2010年版药典收载的有药用的真菌类只有7种[9]。因此，以真菌为原料，进行活性筛选，对活性成分跟踪分离纯化和结构鉴定，利用液体发酵技术定向大量生产活性成分，对新药的开发和利用具有十分重要的意义。本文对柠檬黄蜡伞不同提取部位的抑菌活性进行了初步研究，结果表明，柠檬黄蜡伞子实体的提取物对所选的9种真菌均无明显抑制作用，Gianluca Gilardoni从同科的金粒蜡伞（Hygrophorus chrysodon）新鲜子实体中分离得到 2个 2-酰基环戊烯-1，3-二酮衍生物，chrysotrione A和B，对植物病原菌轮枝样镰孢菌（Fusarium verticillioides）具有抑制作用[10]，本实验柠檬黄蜡伞子实体粗提物对所选的植物病原菌并没有明显的抑制作用，可能是在粗提物中抑菌活性物质含量太低，并未表现抑菌活性，下一步将扩大筛选范围，寻找特异的靶标真菌。石油醚层和乙酸乙酯层对所选细菌均有有较好的抑制作用，下一步对其抑菌活性成分进行跟踪分离和结构研究，同时对其液体发酵工艺进行优化，为进一步的基于活性物质为基础的开发利用提供理论基础。Bertrand Veau从青黄蜡伞（Hygrophorus hypothejus） 分离出 lectin（HHL） 具有凝血的作用[11]。Norman Mier报道金粒蜡伞 （Hygrophorus chrysodon） 和金黄拟蜡伞 （Hygrophoropsis aurantiaca） 对果蝇幼虫有毒杀作用[12]。Antonella Del Signore分析了浅黄褐色蜡伞 （Hygrophorus leucophaeus） 中的总酚含量为4.15%[13]，熊伟从淡红蜡伞菌（Hygrophorus russula Fr.）提取出多糖，多糖得率为6.52%[14]，多酚和多糖具有多种生理活性，本课题组将对柠檬黄蜡伞的化学成分就行全面的分析，探究其是否具有其他的生理活性，为更好的利用这一真菌资源提供理论依据。

表3 柠檬黄蜡伞子实体石油醚成分的气质联机分析结果

[1]戴玉成，周丽伟，杨祝良，等.中国食用菌名录[J].菌物学报，2010，29(1)：1-21.

[2]计红芳，张令文，张磊，等.柠檬蜡伞多糖的提取工艺研究[J].河南科技学院学报，2011，39(4)：20-27.

[3]杨丈胜，王建国.内蒙古森林食用菌及其开发利用[J].内蒙古林业，1991(5)：16-17.

[4]周繇.长白山区野生食用真菌资源调查研究及其开发利用[J].中国食用菌，2002，22(1)：8-10.

[5]孙红.河北省燕山地区野生高等真菌资源调查及五种子实体抗氧化活性研究[D].河北师范大学硕士论文，2010.

[6]万宇，图力古尔，李玉.内蒙古阿尔山地区大型真菌物种多样性研究[J].菌物研究，2009，7(2)：76-85.

[7]佟春兰，包海鹰，图力古尔.蒙古口蘑子实体石油醚提取物的化学成分及抑菌活性[J].菌物学报，2010，29(4)：619-624.

[8]游洋，包海鹰.不同成熟期大秃马勃子实体提取物的抑菌活性及其挥发油成分分析[J].菌物学报，2011，30(3)：477-485.

[9]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

[10]Gianluca Gilardoni,Marco Clericuzio,Solveig Tosi,et al.Antifungal Acylcyclopentenediones from fruiting bodies of Hygrophorus chrysodon[J].J.Nat.Prod.,2007(70):137-139.

[11]Bertrand Veau,Jean Guillot,Mireille Damez,et al.Purification and characterization of an anti-(A+B)specic lectin from the mushroom Hygrophorus hypothejus[J].Biochimica et Biophysica Acta,1999(1428):39-44.

[12]Norman Mier,Sandrine Canete,Alain Klaebe,et al.Insecticidal properties of mushroom and toadstool carpophoresI[J].Phytochemrstry,1996 41(5):1293-1299.

[13]Antonella Del Signore,Francesco Romeo,Mario Giaccio.Content of phenolic substances in basidiomycetes[J].Mycol.Res.,1997,101(5):552-556.

[14]熊伟，张涪平，钟国辉，等.西藏淡红蜡伞菌多糖的提取及单糖组成研究[J].食品与发酵工业，1997，33(10)：171-174.