蟛蜞菊内酯对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

ICR雄性小鼠，60只，体重(20.0±2.0)g，购于扬州大学比较医学中心。合格证号：SCXK(苏)2007-0001。

蟛蜞菊内酯自提，纯度98%，CCl4为国产分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号20091123，用植物油配成0.15%CCl4;联苯双酯，购自浙江万邦药业有限公司，用吐温-80配成100g/L;谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，谷胱甘肽(GSH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号为20101223，20101224，20101228，20101227，20101223。

1.2 实验方法及数据处理

小鼠60只(20.0±2.0)g，随机分为6组，每组10只。分模型组、空白组，蟛蜞菊内酯低剂量(11 mg/kg)，中剂量(22 mg/kg)，高剂量组(44 mg/kg)及阳性药组(为0.1 g/kg的联苯双酯)，给药体积为20 mL/kg。空白组按20 mL/kg灌胃给予0.5%的吐温-80溶液。给药组和阳性药组先分别连续灌胃给药7天，每天1次，第6天上午给药后1 h，模型组与阳性药组一次性腹腔注射0.15%的CCl4溶液造成肝损伤。造模后20 h，眼框取血，3 500 r/min离心5 min，分离血清，用生化分析仪测定血清中谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)活性。并取肝脏右叶同一部位经10%甲醛固定，HE染色作病理检查，另取小块肝脏组织，用冷生理盐水洗去浮学，拭干，称取0.5g肝组织，加5mL冷生理盐水制成10%的肝匀浆，放入-20℃冰箱中备测超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，谷胱甘肽(GSH)指标。

实验数据如表所示，采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析。

2 实验结果

2.1 对小鼠血清中ALT、AST的影响

由表1可以看出，模型组与正常组相比，血清ALT，AST水平极显著升高(P＜0.01)，说明建模成功。与模型组相比，蟛蜞菊内酯各剂量组血清ALT，AST水平均明显降低，且呈剂量依赖性，统计学比较差异显著(P＜0.01)，中剂量与阳性药联苯双酯的药效相当，表明蟛蜞菊内酯可以减轻CCl4所致小鼠急性肝损伤。

表1 蟛蜞菊内酯对CCl4肝损伤小鼠血清ALT、AST活力的影响(±s，n=10)

注：与空白组比较*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组别剂量(mg/kg) ALT(U/L) AST(U/L)- 12.59±5.47 12.29±3.14模型 - 91.03± 26.89＊＊ 85.62± 40.48＊＊蟛蜞菊内酯 11 42.72± 21.83△△ 24.181± 3.89△△22 33.50 ± 29.34△△ 19.35 ± 12.40△△44 26.25 ± 11.35△△ 12.87 ± 4.92△△联苯双酯 100 30.49±14.17△△ 18.87± 11.39空白△△

2.2 对小鼠肝脏SOD，MDA，GSH的影响

各组小鼠SOD，MDA，GSH活力见表2。由表2可以看出，模型组与正常组相比，MDA明显增高，SOD显著降低，GSH显著升高(P＜0.01)，说明建模成功。蟛蜞菊内酯各剂量与模型组相比，肝组织MDA明显降低(P＜0.01)，SOD明显增高(P＜0.05，P＜0.01);GSH 明显降低(P＜0.01)，且呈剂量依赖关系，高剂量组中各个指标均高于阳性药物组，结果表明蟛蜞菊内酯可能具有一定的抗氧化作用。

表2 蟛蜞菊内酯对CCl4肝损伤小鼠肝脏MDA含量、SOD和GSH活性的影响(±s，n=10)

与空白组比较*P＜0.05，＊＊P＜0.01与模型组比较△P＜0.05，△△P ＜0.01

组别剂量(mg/kg)MDA(mol/mg)SOD(ng/mg pro)GSH(μg/mg pro)- 0.78±0.28 74.68±22.45 2.16±1.24模型 - 1.21 ±0.30＊＊ 21.56±3.54＊＊ 8.24 ±3.91＊＊蟛蜞菊内酯 11 0.83 ±0.24△△ 25.16±3.76△ 3.28 ±2.27△△22 0.77 ±0.31△△ 37.56±16.81△△ 2.46±1.89△△44 0.79 ±0.25△△ 49.52 ±23.20△△ 2.24 ±2.75△△联苯双酯 100 0.92±0.29* 29.66±11.68 3.50±3.16空白△△

2.3 蟛蜞菊内酯对肝损伤小鼠肝脏病理改变的影响

按照上述实验方法，取给药7 d后各组的小鼠肝脏进行组织病理学观察。结果表明，正常组，肝小叶结构清楚，肝索放射状排列，肝细胞结构清晰，核居中;汇管区未见炎细胞浸润。肝损伤模型组可见肝小叶结构清楚，肝索呈放射状排列，肝细胞呈灶性细胞水肿，可见肝细胞点状坏死及碎片状坏死。蟛蜞菊内酯给药组肝小叶结构清楚，敢说呈放射状排列，肝细胞造型细胞水肿，肝细胞点状坏死及碎片状坏死明显减轻，与模型组相比各给药组肝脏病理变化均有所改善(图2)。

图2 蟛蜞菊内酯对CCl4致小鼠肝损伤组织病理形态学的影响

3 讨论

本文选择经典的CCl4化学性肝损伤的动物模型来研究墨旱莲中蟛蜞菊内酯的肝脏保护作用，CCl4诱导的急性肝损伤动物模型是筛选保肝药物和抗肝纤维化的较常用的动物模型之一。CCl4肝损伤机制研究较多，存在多种意见，但一直公认，主要与脂质过氧化物有关，脂质过氧化物使细胞膜流动性降低，通透性增高，线粒体膜受损，细胞产能障碍，活性氧生成增多，造成细胞损伤［6］。CCl4能够在肝内主要被CCl4能够在肝内主要被微粒体细胞色素氧化酶代谢，生成2个活性自由基(·CCl3和·Cl)及一系列氧活性产物，通过脂质过氧化物的破坏，使细胞膜系统发生脂质过氧化反应，膜磷脂大量降解，从而破坏生物膜结构的完整性，引起膜通透性升高影响细胞代谢功能和能量的生成［7］。肝细胞在上述自由基损伤作用下，会释放出特异的标志性的酶成分。例如ALT存在于肝细胞浆中，肝内酶活性较血清约高100倍，因此只要有1%肝细胞坏死，即可使血浆中的ALT上升1倍，因此它是检测肝细胞损伤最敏感的指标之一。AST在心肌细胞中含量最高，肝为第二位，在肝损害时其漏出量较ALT低。本研究中模型组血清的ALT和AST水平显著升高，阳性药、各剂量给药组均能显著降低ALT、AST，显示保护肝细胞的作用。蟛蜞菊内酯在11 mg/kg～44 mg/kg范围内成剂量依赖，中剂量与阳性药联苯双酯的药效相当。SOD是体内降解、清除自由基的主要抗氧化酶。在自由基诱发的脂质过氧化过程中，不饱和脂肪酸氧化分解可释放MDA等醛类物质，因此可以通过检测MDA含量来反映机体脂质过氧化损伤的程度［8］。本次研究中可以看出给予CCl4后，SOD极显著降低，MDA和GSH极显著升高，蟛蜞菊内酯低、中、高剂量各组能够显著升高SOD水平。同时可显著降低MDA和GSH水平。此结果说明蟛蜞菊内酯具有一定的抗氧化作用。与模型组比较，各剂量组中病理组织形态学有明显改善，随剂量增加而药效明显。

综上所述。蟛蜞菊内酯对于四氯化碳所致急性肝损伤具有明显保护作用，本研究提示了蟛蜞菊内酯的可能作用机制，为进一步研究此活性物质的体内代谢与组织分布提供了依据。

［1］ Govindanchari T R，Nagurajan K，Pai B R.Chemical examination of Wedelia calendulacea..Part 1.Structure of wedelolactone［J］.Chem Soc，1956：629-632.

［2］ Mors W B，Nascimento M C，Parente J P，et al.Neutralization of lethal and myotoxic activities of South American rattlesnake venom by extracts and constituents of the plant Eclipta prostrate(Asteraceae)［J］.Toxicon，1989，27(9)：1003-1009.

［3］ Wagner H，Geyer B，Kisp Y，et al.Coumestans as the main active principles of the liver drugs Eclipta alba and wedelia calenulaceae［J］.Planta Med，1986，10(5)：370-374.

［4］ Kobori M，Yang Z，Gong D，et al.Wedelolactone suppresses LPS-induced caspase-11 expression by directly inhibiting the IKK complex［J］.Cell Death Differ，2004，11：123-130.

［5］ Saxena A K，Singh B，Anand K K.Hepatoprotective effects ofEclipta alba on subcellular levels in rats［J］.Journal of Ethnopharmacology，1993，40(3)：155-161.

［6］ Shah H，Hartman S P，Weinhouse S.Formation of carbony chloride in carbon tetrachloride metabolism by rat liver in vitro［J］.Cancer Res，1979，39(10)：3942.

［7］ Berger M L，Bhatt H，Combes B，et al.CCl4induced toxicity insolated hepatocytes，the importance of direct solvent injury［J］.Hepatology，1986，6(1) ：36-45.

［8］魏屏，彭汉光，黄坤，等.加味四逆散对D氨基半乳糖所致急性肝损伤大鼠体内脂质过氧化的影响及病理改变同步观察［J］.同济医科大学学报，2000，29(3)：268-270.

Effects of Wedelolactone on Mice’s Acute Hepatic Injury Induced by Carbon Tetrachloride

Ping Ping，Zhang Chaofeng*，Xu Xianghong，Zhang Mian
(Key Laboratory of Modern Chinese Medicines，Ministry of Education;Research Department of Pharmacognosy，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China)

Objective：To estimate the effect of Wedelolactone on mice’s acute hepatic injury caused by carbon tetrachloride(CCl4).Methods：The model of acute hepatic injury caused by CCl4was obtained on mice，and the content of AST，ALT in mice serum，MDA and SOD in mice liver cell were evaluated，and the section form of liver pathological organization were also observed.Results：Wedelolactone could markedly inhibit the activities ALT，AST and the levels of MDA，increased the activities of SOD，in addition，histological changes were effectively lessened.Conclusions：Wedelolactone has significant effect on protecting mice’s acute hepatic injury caused by CCl4the mechanism may be related to its anti-oxidative action.

wedelolactone;hapatic injury;carbon tetrachloride

R285.5

1006-9690(2012)05-0041-03

10.3969/j.issn.1006-9690.2012.05.0011

2012-02-14

国家基础科学人才培养基金(NFFTBS)(J0630858)

平萍(1987-)，女，汉族，山西长治人，硕士研究生，研究方向：生药活性成分与质量标准研究。

*通讯作者：张朝凤，副研究员。E-mail：njchaofeng@126.com