木枣试管苗叶片POD同功酶特性研究

齐向英，奚增军，陈宗礼，张向前，李志强，任 宽

(陕西省红枣重点实验室(延安大学)延安大学生命科学学院，陕西延安716000)

木枣试管苗叶片POD同功酶特性研究

齐向英，奚增军，陈宗礼*，张向前，李志强，任 宽

(陕西省红枣重点实验室(延安大学)延安大学生命科学学院，陕西延安716000)

以木枣试管苗叶片为材料，以愈创木酚为底物，研究其POD同功酶动力学，结果表明：木枣试管苗叶片POD同功酶酶促反应的最适pH值为5.0，最适温度范围为42～46℃之间，Km值为40.66mmol/L，Vmax值为673.6U/s·gFW。在H2O2浓度为0.4%的反应体系中，反应3～18 min内测定酶活可获得较好的结果。

木枣;试管苗;叶片;POD同功酶

枣(Zizupus jujube Mill.) 是我国特有植物［1］，《中国果树志·枣卷》记载我国有枣树品种700多个。由于枣树具有耐涝、耐寒、耐贫瘠等特点，所以一直被誉为“铁杆庄稼”。枣树这些特性和其体内的酶系统是分不开的。过氧化物酶(POD)是一种底物较为广泛的氧化酶类，在高等植物中广泛而大量地存在着［2］。枣树过氧化物酶研究已有报道，但其主要研究集中在用过氧化物酶作系统分类［3－6］、枣树病变和酶变化的关系研究［7］、水分胁迫对酶活的影响分析［8］、酶活不同时期的变化［9］等方面。有关枣树过氧化物酶特性和动力学的研究一直未见报道。本研究从木枣试管苗叶片中提取枣树POG同功酶，并对该酶的特征、动力学参数做了研究，以其为试管生态条件下枣树体内POD同功酶的合理调控提供依据，同时为枣树POD同功酶在其它生态条件下的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用材料为木枣继代培养的试管苗，按延志莲［10］等方法将木枣试管苗继代培养30d，取其由顶向下的第2、3片展开的叶子作为实验材料。

1.2 方法

1.2.1 酶液粗提 称取枣树试管苗叶片1 g，加2 mL样品提取液于预冷研钵中，在冰浴中研磨，并分3次共用8 mL样品提取液清洗研钵。粗提酶液于4℃、8 000 r/min、离心10 min，上清液即为酶液。将粗提酶液在4℃下保存备用。

1.2.2 酶活测定 采用愈创木酚法进行测定。在试管中加入1 mL的酶液、1 mL 0.4%的愈创木酚和1 mL pH=6的磷酸缓冲液，摇匀后置于30℃水浴中预热5 min，然后快速加入1 mL蒸馏水，并开始计时，立即用紫外—可见分光光度计测定1 min内△OD470。在实验组试管中加入1 mL的酶液、1 mL的愈创木酚和1 mL磷酸缓冲液，摇匀后置于30℃水浴中预热5 min，然后快速加入1 mL H2O2，并开始计时，立即用紫外—可见分光光度计(岛津UV－1601)测定1min内△OD470。一个酶活单位为每克鲜重样在1 s内使OD值升高0.1(以unit/s·g FW表示)。

1.4 POD同功酶最适pH值测定

在不同pH值的缓冲液中测定酶液活性，确定POD同功酶最适pH值。pH值的范围从pH 2.0～12.0，每隔0.5个单位梯度进行测定，温度30℃，重复测定3次。以最大活性管的值为100%，计算其相对活性。

1.5 POD同功酶最适温度的测定

在pH 4.6的条件下，在10～100℃范围内每隔2℃，测定酶液POD同功酶的活性，确定其最适温度。以最大活性管的值为100%，计算其相对活性。

1.6 H2O2对POD同功酶活性的影响的测定

设置 H2O2的浓度分别为 0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%(v/v)，在其它条件相同的情况下测定POD同功酶的活性，以最大活性管的值为100%，计算其相对活性。

1.7 POD的Km值和Vmax值的测定

以愈创木酚为底物，设置 4、10、12、14、16、18、20 mmol/L的底物浓度，在pH 5.0，30℃条件下分别测定POD活性。用Lineweaver－Burk的双倒数法［10］进行曲线回归计算，求得Km值和Vmax值。

2 结果与分析

2.1 pH值对木枣试管苗叶片POD同功酶活性的影响

一般情况下酶的活性随反应体系pH值的变化而变化，在某一pH范围内表现出酶的最高活性，这个pH称为酶的最适pH。木枣试管苗叶片POD酶活性研究结果表明(见图1)，木枣试管苗叶片POD酶活在pH为5.0是的活性最大。以pH为5.0时的POD酶活为100%，在pH＞7.0或者pH＜3.0时约有50%的POD酶活性被抑制，pH＞8.5时约有80%的POD酶活性被抑制。在3.5＜pH ＜5.0或者5.0＜pH ＜7.0之间约有20%的POD酶活性被抑制。

图1 pH对木枣试管苗叶片POD同功酶活性的影响

2.2 H2O2值对木枣试管苗叶片POD同功酶活性的影响

在植物体内，POD同功酶可以催化H2O2的分解，在一定量的过氧化氢下，POD同功酶能够发挥较大的催化作用，当H2O2超过一定的浓度，POD的活性就会降低(见图2)。木枣试管苗叶片POD酶活性研究结果表明，在H2O2浓度为0.4%的反应体系中，木枣试管苗叶片POD同功酶的活性最大。以H2O2浓度为0.4%时的POD酶活为100%，在反应体系中0.1% ＜H2O2＜0.4%或者0.4% ＜H2O2＜0.8%的反应体系中由20%的酶活性被抑制，在反应体系中0.8% ＜H2O2＜1.6%的反应体系中约有40%的酶活性被抑制。

图2 H2O2对木枣试管苗POD同功酶活性的影响

2.3 温度对木枣试管苗叶片POD同功酶活性的影响

一般情况下，随温度的升高酶的活性会增加，当温度升的某一范围时，酶的活性达到最大值，这是的温度称为酶促反应的最适温度。如果温度继续增加酶的活性就会降低。木枣试管苗叶片POD酶活性研究结果表明(见图3)，在反应体系的温度为42℃～46℃时木枣试管苗叶片POD同功酶的活性达到最大值，以这一温度范围的值为100%。在温度为28℃ ＜T＜40℃或者48℃ ＜T＜52℃的范围内约有20%的POD酶活性被抑制;在温度为18℃ ＜T＜26℃或者54℃ ＜T＜70℃范围内约有40%的POD酶活性被抑制;但在反应体系为2℃ ＜T＜74℃范围内均能表现出40%的酶活。

图3 温度对木枣试管苗叶片POD同功酶活性的影响

2.4 反应时间对木枣试管苗叶片POD同功酶活性的影响

反应时间显示的酶促反应的快慢，通过对木枣试管苗叶片POD同功酶活性的研究发现，随反应时间的增加酶活显示出先增加，后减低的趋势(图4)。测定结果显示在反应的6～7 min，木枣试管苗叶片POG同功酶活达到最大值，在反应4～10 min内测定木枣试管苗叶片POD同功酶活性可得到较好的结果。反应时间小于3 min或者大于18 min不适合木枣叶片POD同功酶活性的测定。

图4 反应时间多木枣试管苗POD同功酶活性的影响

2.5 木枣试管苗叶片POD同功酶酶促反应的动力学参数Km和Vmax

当底物浓度很低时，酶促反应速度与底物浓度成正比，当底物浓度达到一定限度时，所有酶全部与底物结合，反应速度达到最大值(Vmax)。米氏常数Km表示酶与底物亲和力的大小，它相当于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，其倒数被称为亲和力常数。利用双倒数法对1/［S］和1/V作图(图5)并进行一元线性回归，计算出木枣试管苗叶片POD同功酶以愈创木酚为底物的Km值为40.66mmol/L，Vmax值为 673.6U/s·g FW。说明木枣试管苗POD同功酶与愈创木酚的亲和力较好。

图5 木枣试管苗POD同功酶酶促反应双倒数曲线

3 讨论

实验表明木枣试管苗叶片POD同功酶酶促反应的最适pH值为5.0，最适温度范围为42～46℃之间。冯晓霞等［11］以石榴果皮为材料的研究结果显示以愈创木酚为底物时，最适pH值为6.5，最适温度为40℃反应时间不宜超过15 min，底物浓度宜大于0.03 mol/L，反应完成后在40 min内测定POD的活性最为稳定。时忠杰［12］等对板栗叶片POD的研究表明其最适pH为4.6，最适温度为38℃，最适H2O2浓度为0.1%，Km值为128.17 mmol/L，Vmax值为281.68 U/(s·gFW)。田呈瑞［13］在以经清洗后去皮去核的新鲜芒果为材料研究发现芒果POD同功酶最适pH值为4.75，在75℃下加热处理20 min或50℃下处理5 min，可使过氧化物酶完全失活。谢永红等［14］以锦橙成熟春梢叶片提取过氧化物酶(POD)，测定发现其最适pH为5.0，最适温度为32℃。李建芳等［15］以新鲜鱼腥草根部为材料的研究结果表明鱼腥草POD的最适pH值为7.0、最适温度为45℃。这说明虽然POD同功酶是植物体内存在广泛的酶类，但因物种的不同POD同功酶的最适pH和温度也不一定相同。偏离最适温度和pH值酶的活性将受到很大的影响。本实验中H2O2的浓度为0.4%的反应体系中测定木枣试管苗叶片POD同功酶活性较好。测定的反应时间应该控制在3～18 min之间。以愈创木酚为底物通过一元回归测定得到木枣试管苗叶片POD同功酶的Km值为40.66mmol/L，Vmax值为673.6U/s·gFW。这与上述学者在其他物种上的研究也有所不同。木枣试管苗叶片和其它底物结合的最适温度范围、最适pH值、Km值和Vmax值是否与其有同样的趋势还有待进一步研究。

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［4］ 苏冬梅，陈书君，毕方铖.酸枣及17个枣品种叶片过氧化物酶同工酶的研究［J］.园艺学报，2001，28(3)：265－267.

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Studies on Peroxidase Activities with in vitro Leaves of Chinese Jujube，Mu Zao

Qi Xiangying，Xi Zengjun，Chen Zongli，Zhang，Xiangqian，Li Zhiqiang，Ren Kuan
(Shaanxi Key Laboratory of Chinese Jujube(Yanan University)College of Life Science，Yan＇an University，Yan＇an 716000，China)

Study on POD isozymes of Chinese Jujube，with the test tube seedling leaves of Muzao，Guaiacol as substrate.The results show that：the optimum pH for leaves of Muzao POD isoenzyme in enzymatic reactions of is 5;the optimum temperature range between 42－46℃;the value of Km is 40.66mmol/L;the value of Vmax is 673.6U/s g FW.In H2O20.4%concentration in the reaction system，reaction 3 －18 min determination of endogenous enzyme activity can obtain better results.

Muzao;in vitro plant;leaves;peroxidase

Q945

A

1006－9690(2012)05－0020－04

10.3969/j.issn.1006－9690.2012.05.0005

2012－03－06

陕西省自然科学基金项目(2009JM3001－3);陕西省重点实验室专项(05JS39);延安大学科技创新项目(YD2011－145)

齐向英(1980－)，男，陕西宝鸡人，讲师，硕士，研究方向：植物生物技术与植物遗传育种。E－mail：yd_qixiangying@163.com

*通讯作者：陈宗礼(1954－)，男，陕西扶风人，教授，硕士生导师。研究方向：植物组织培养与植物遗传育种。E－mail：zongli_chen@yahoo.com.cn