杠柳苷元抑制人乳腺癌细胞增殖作用的研究

李海霞 韩琛 李一光

杠柳是主产于中国辽宁、吉林、河北、山东、山西等省区的一种萝藦科植物［1］，其干燥的根皮即称为“香加皮”，含有甾醇、酯类等多种化合物［2］，具有祛风湿、强筋骨、利尿、驱虫、升压等多种药理功效［3］。

近年来，随着中药有效成分研究的进展，对于传统中药香加皮研究发现了多种不同于传统应用的药理学作用，例如抗炎作用［4］、强心作用［5］、抗癌作用［6］等，而其中杠柳苷元是香加皮产生抗炎作用的物质基础［4］，并在香加皮抗肿瘤的过程中发挥了重要作用。为观察杠柳苷元的体外抗乳腺癌细胞的作用，对其机制做较为深入的探讨，特开展本实验，为客观评价和进一步开发研究其临床应用价值提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 杠柳苷元由中药香加皮提取纯化而得到，纯度大于98%;MCF7由沈阳药科大学中日医药研究所惠赠;DMEM培养液购自Hyclone公司(UT，USA);胎牛血清购自TBD 公司(天津，中国)，proCaspase-9、Caspase-9、Caspase-3 抗体及辣根过氧化酶标记的二抗购自Santa Cruz公司(CA，USA)，MTT购自Sigma公司(MO，USA)。其他试剂均为分析纯。使用的仪器为二氧化碳培养箱(NuAir，USA)，DYYIII28A型蛋白电泳仪(北京，中国)，酶联免疫分析仪(Tecan，Austria)。

1.2 实验方法 ①MTT法:取处于对数生长期的MCF7细胞，以1×105cell/ml的密度接种于96孔板中，每孔100 μl，培养18 h后，加入含有杠柳苷元(0-160 μm)的培养液，于37℃，5%CO2条件下继续培养18 h，在显微镜下观察细胞形态学的变化后，每孔加入 MTT 15 μl(5 g/L)，DMSO150 μl溶解后，于酶标仪492 nm处检测，测定吸光值，并计算抑制率，绘制各点的抑制率反应曲线。

抑制率(%)=［A492(control)-A492(periplogenin)］/［A492(control)-A492(blank)］×100%。②蛋白免疫印迹法:将MCF7细胞以5×105cell/ml的密度接种于培养瓶中，每瓶8 ml，培养18 h后，加入浓度为0和75 μm的杠柳苷元，作用6、12、18 h后，用0.05%的胰酶将MCF7细胞消化下来，终止消化并将细胞混悬液离心。加入细胞裂解液冰浴裂解30 min，12000r/min离心10 min后提取上清，测定蛋白浓度，以10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，并将蛋白过夜转移到硝酸纤维素膜上，封闭后加入小鼠抗人Caspase-3、兔抗人Caspase-9以及兔抗人proCaspase-9孵育过夜，漂洗后加羊抗鼠或羊抗兔的二抗结合，漂洗后用TTBS洗膜，加入ECL显影剂显色后用胶片曝光，定影后得到上述蛋白的条带。

2 结果

2.1 杠柳苷元对MCF7细胞生长和增殖的抑制作用。

如图1所示，杠柳苷元以40 μm及以上的浓度作用于MCF7细胞18 h时，均具有明显地抑制作用(P＜0.05)，且此抑制作用呈剂量依赖性。其半数抑制浓度为97 μm。

图1 杠柳苷元对MCF7细胞的抑制作用

2.2 杠柳苷元对MCF7内相关凋亡蛋白的影响。

如图1所示，当75 μM的杠柳苷元作用于MCF7时，能够促进细胞内凋亡蛋白casepase-3蛋白的表达以及proCaspase-9转化为Caspase-9，且促凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3在细胞内的表达呈时间依赖性地增加。

图2 杠柳苷元对MCF7内相关凋亡蛋白的影响

3 讨论

目前普遍认为恶性肿瘤化学治疗药物引起肿瘤消除的机制是促进肿瘤细胞死亡和阻止其增殖，细胞死亡既可以通过坏死又可通过凋亡的形式进行［7］。细胞凋亡成为恶性肿瘤药物治疗的新目标，越来越多的研究成果使人们从细胞凋亡角度设计新的抗肿瘤治疗策略、提高药物治疗效果［8］。

Caspase家族在细胞死亡信号传导过程中起核心作用，Caspase-3是Caspase家族中最重要的细胞凋亡执行者之一，在蛋白酶级联切割过程中它处于核心位置，发挥着非常重要的作用，一旦被激活就会导致细胞凋亡，因此被称为促凋亡蛋白。它可以通过死亡受体介导途径与线粒体依赖途径来诱发细胞凋亡。Caspase-9也是凋亡过程中的重要蛋白，当存在于细胞膜表面死亡受体与相应的配体结合后，作为起始凋亡蛋白的proCaspase-9被剪切活化为Caspase-9，进一步激活下游的Caspase-3蛋白，最终引发细胞凋亡［9］。本次研究发现杠柳苷元可以时间依赖性地促进细胞内凋亡蛋白Caspase-3的增加并促使凋亡蛋白前体proCaspase-9剪切活化生成Caspase-9，说明杠柳苷元发挥抗肿瘤作用可能是通过促进肿瘤细胞凋亡来实现的。

1987年Hideji Itokawa等首次报道香加皮的氯仿一甲醇(10∶1)洗脱部位有抗肿瘤作用并从中分得杠柳苷元［10］，但在此之后关于杠柳苷元的药效物质基础研究及其抗肿瘤研究并不多见，关于其抗肿瘤的机制更是知之有限。本研究通过蛋白免疫印迹法检测发现经75 μM杠柳苷元作用后的MCF7细胞中proCaspase-9的表达量明显呈时间依赖性地降低，而Caspase-9的表达量增加，由此推测杠柳苷元能够诱导MCF7细胞凋亡可能是通过增加Caspase-9表达，进一步激活下游凋亡蛋白Caspase-3，而 Caspase-3表达增加，诱导下游蛋白表达，最终诱导细胞凋亡。

［1］ 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志．北京:科学出版社，1977:273-274．

［2］ 张援虎，王锋鹏.杠柳属植物化学成分研究进展.天然产物研究与开发，2003，15(2):157-161．

［3］ 国家药典委员会.中国药典一部．北京:化学工业出版社，2005:181．

［4］ Yi-Na Zhu，Wei-Min Zhao，Yi-Fu Yang，et al.Periplocoside E，an Effective Compound from Periploca sepium Bge，Inhibited T Cell Activation in Vitro and in Vivo．The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2006，316(2):662-669．

［5］ 李玉红，高秀梅，张伯礼，等.香加皮提取物对离体心脏功能的影响．辽宁中医学院学报，2005，7(4):396-397．

［6］ 陈书红，杨峻山，任风芝，等.香加皮的抗肿瘤活性成分研究．中草药，2006，37(4):519-520．

［7］ Park JA，Kin KW，Kin SI，et al.Caspase3 specifically cleaves p21WAF1/C IP1 in the earlier stage of apoptosis in SK-HEP-1 human hepatoma cells．Eur J Biochem，1998;257(1):242-248．

［8］ Kim HE，Oh JH，Lee SK，et al.Ginsenoside Rh2 induces apoptotic cell death in rat C6 gliomal via a reactive oxygen and caspase-dependent but Bcl-X(L)-independent pathway．Life Sci，1999，65(3):33-40．

［9］ Ruiz-Vela A，Korsmeyer SJ.Proapoptotic histone H1.2 induces CASP-3 and-7 activation by forming a protein complex with CYT c，APAF-1 and CASP-9.FEBS Lett，2007，581:3422．

［10］ Hideji Hokawa.Studies on Chemical Constituents of Antitumor Fraction from Periploea Sepium．Chem Pharm Bull，1988，36(3):982-988．