反相高效液相色谱法测定复方水杨酸酊中水杨酸和苯甲酸含量

黄 洁，李锋武，刘鹏鸣，范 菲，单 敏

(陕西省西安市食品药品检验所，陕西 西安 710054)

复方水杨酸酊的主要成分为水杨酸和苯甲酸，临床上主要用于手足癣、体癣、股癣及花斑癣等的治疗。卫生部《中国医院制剂规范(第二版)》(1995年)中采用中和法测定复方水杨酸酊的总酸量，但不能分别测定水杨酸和苯甲酸的含量，故不能有效控制制剂的质量。国家药品标准[1]中其含量测定项下水杨酸采用紫外分光光度法，专属性不强;苯甲酸采用容量分析法，操作烦琐，且消耗样品和试剂的量大。笔者参考文献[2－3]，建立了可同时测定复方水杨酸酊中水杨酸和苯甲酸含量的高效液相色谱法，操作简单，灵敏度高，重现性好，现报道如下。

1 仪器与试药

Ultimate U－3000型高效液相色谱仪(美国戴安公司);TU－1901型紫外可见分光光度计(美国普析通用仪器有限公司)。水杨酸对照品(批号为100106－200303)，苯甲酸对照品(批号为100419－200301)，均由中国药品生物制品检定所提供;复方水杨酸酊(西安市中心医院自制制剂，批号为20100406，20100412，20100413);乙腈(色谱纯，Merck公司)，四氢呋喃(色谱纯，Merck公司)，水为三蒸水(自制)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Phenomenex Luna C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈－四氢呋喃－冰醋酸－水(20∶5∶5∶70);流速:1.0 mL/min;检测波长:231 nm;进样量:10 μL。在上述色谱条件下，对照品及样品中苯甲酸和水杨酸均能完全分离。色谱图见图1。

2.2 溶液配制

取处方中除水杨酸与苯甲酸之外的成分，即乙醇，作为阴性对照品溶液。精密称取水杨酸、苯甲酸对照品适量，用乙醇溶解并稀释制成分别含水杨酸、苯甲酸 51.6 μg/mL 和 100.1 μg/mL 的对照品贮备液。精密量取样品5 mL，置100 mL容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取2 mL，置100 mL容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

线性关系考察:分别精密吸取对照品贮备液2，4，6，8 mL，置10 mL容量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X)为横坐标进行线性回归。水杨酸和苯甲酸的线性回归方程分别为 Y=17 686 564.922 5 X+19 117.430 0(r=0.999 6)和 Y=17920994.0060X+15388.5800(r=0.9999)。结果表明，水杨酸与苯甲酸质量浓度分别在 10.3～51.6μg/mL 和20.0～100.0μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:取同一对照品溶液，重复进样5次。结果水杨酸与苯甲酸的 RSD分别为0.92%和0.60%(n=5)，表明仪器精密度良好。

重复性试验:取同一批样品5份，依法制备供试品溶液并测定含量。结果水杨酸与苯甲酸的 RSD分别为0.56%和0.95%(n=5)，表明方法重复性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别配制后于 0，2，4，8，12 h进样，依法测定。结果水杨酸和苯甲酸含量的 RSD分别为1.8%和1.1%(n=5)，表明供试品溶液至少在12 h内保持稳定。

加样回收试验:精密量取样品5 mL，置100 mL容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，分别精密加入混合对照品溶液(含水杨酸288.6 μg/mL、苯甲酸547.9 μg/mL)4.0，6.0，8.0 mL，加乙醇稀释至刻度，摇匀。每个质量浓度分别配制3份溶液，按供试品溶液制备方法处理并测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n=9)

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法分别制备供试品溶液，分别取对照品溶液和供试品溶液，进样10 μL，按外标法计算含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

配制水杨酸和苯甲酸的对照品溶液，分别于200～400 nm波长测定紫外吸收光谱，结果各待测物质最大吸收波长水杨酸为303，235，210 nm，苯甲酸为 272，228，202 nm。为了兼顾两种组分的测定灵敏度，决定采用231 nm作为检测波长。

试验中曾采用甲醇－水(40∶60)、0.1 mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节 pH 至 5.0)－甲醇(60∶40)、0.4%三乙胺溶液(用磷酸调节pH至2.5)－甲醇(45∶55)作为流动相，得到的峰形不好且理论板数差。采用乙腈－四氢呋喃－冰醋酸－水(20∶5∶5∶70)作为流动相，得到的峰形好且理论板数高。

试验过程中使用了美国Phenomenex C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)、大连依利特 YWGC18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)、江苏汉邦科技 Kromasil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，按拟订方法进行含量测定，结果各组分之间的分离度均大于1.5，表明该方法耐用性良好。试验中将该方法与原标准分析方法比较，结果近似。由于采用该方法可以同时测定水杨酸和苯甲酸的含量，操作简便，结果准确可靠，故可以作为复方水杨酸酊中水杨酸和苯甲酸含量的测定方法。

[1]WS－10001－(HD－1472)－2003，国家食品药品监督管理局标准·化学药品地标升国标(第十五册)[S].

[2]齐腊梅.HPLC同时测定复方苯甲酸酊中的苯甲酸和水杨酸[J].华西药学杂志，2008，23(60):716 －717.

[3]杨锡祥，宗 桥，韩 路，等.复方苯甲酸酊含量测定方法的改进[J].安徽医药，2007，11(9):799 －800.