高效液相色谱法测定四乙酰葛根素的含量及有关物质＊

胡人月，张 毅，陈国庆，杜洪飞，杨大坚

(重庆市中药研究院，重庆 400065)

葛根素在临床上用于治疗冠心病、突发性耳聋、偏头痛及视网膜动脉或静脉阻塞，但其在水和有机溶剂中的溶解度均较低，导致口服葛根素生物利用度极低。本课题组对葛根素进行乙酰化，制备了四乙酰葛根素(tetra－acetylated puerarin，TAP)。生物利用度试验表明，TAP的口服生物利用度高于葛根素[1－2]。课题组进行了相关药理试验[3－5]，表明TAP具有开发为创制新药的潜力。为了进一步推进该化合物的研究进程，本试验建立了测定TAP的含量及有关物质的方法。该方法简便、准确、专属性强，可用于该原料药的质量控制。

1 仪器与试药

Agilent高效液相色谱仪(G1322A Degasser，G1312B Bin Pump SL，G1329B ALs SL，G1316B TLC SL);乙腈为色谱纯(TEDIA，USA)，其余试剂均为分析纯，水为超纯水;AUW十万分之一电子分析天平(日本岛津公司);TAP 样品(批号为 091221，100118，100308)、中间体A、中间体B和TAP对照品均由重庆市中药研究院提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent XDB －C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈 － 水(45 ∶55);流速:1.2 mL/min;检测波长:250 nm;进样量:5 μL;柱温:30℃。理论板数按TAP计算不低于3 000，USP拖尾因子为1.12。

2.2 专属性试验

称取TAP样品适量，流动相配置成1 g/L的溶液，作为破坏试验样品贮备液。取2 mL上述贮备液，分别经过0.025 moL/L盐酸溶液、0.025 mol/L的氢氧化钠溶液、0.5%双氧水溶液各2 mL(室温)24 h和光照 24 h(照度为4 750 lx)，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节至中性，加流动相稀释至10 mL，经高效液相色谱仪分析测定。结果表明，各降解产物与TAP均能良好分离。见图1。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

线性关系考察:取TAP对照品10.38 mg，置10 mL容量瓶中，精密称定，加流动相配置成1.038 g/L的溶液，再逐级稀释，分别配置成 0.020 76，0.051 9，0.083 04，0.1 038，0.124 56，0.155 7，0.186 84 g/L 的溶液，各进样 5 μL，以峰面积(Y)为纵坐标、进样质量浓度(X)为横坐标作图，得线性方程为 Y=12 871 X －24.554，r=0.999 9(n=7)。结果表明，TAP 进样量在0.103 8 ～0.934 2 μg之间与峰面积呈良好线性关系。

检测限和定量限试验:用流动相将TAP对照品溶液(0.092 4 g/L)逐步稀释，测定TAP的 S/N=3时检测限为6.65 ng/mL，S/N=10 时定量限为 0.07 μg/mL。

精密度试验:取TAP对照品溶液(0.0519，0.1038，0.1557g/L)，照2.1项下色谱条件分别连续进样6次，每次5 μL。结果3个浓度溶液测定峰面积的 RSD分别为0.09%，0.17%，0.22%(n=6)，表明方法精密度良好。

重复性试验:取6份样品(批号为091221)，依法制备供试品溶液并测定。结果TAP平均含量为98.58%，RSD为0.17%(n=6)，表明方法重现性好。

稳定性试验:取重复性试验的供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h时进样，照2.1项下色谱条件进行测定。结果TAP含量的 RSD为0.11%(n=6)，表明供试品溶液在室温下24 h内稳定。

加样回收试验:分别取TAP对照品9.24mg，TAP样品9.98mg，置10 mL容量瓶中，精密称定，加流动相至刻度配置成0.924 g/L的对照品贮备溶液和0.998 g/L的样品贮备溶液。分别吸取对照品贮备溶液和样品贮备溶液 0.4，0.5，0.6 mL 混合于 10 mL 容量瓶中各3份，加流动相至刻度作为样品溶液;取上述对照品贮备溶液1 mL，置10 mL容量瓶中作为对照品溶液，各进样5 μL，计算回收率。结果平均回收率为99.94%，RSD=1.32%(n=9)。

耐用性试验:分别考察了流动相比例[乙腈－水(40∶60)、乙腈 － 水(45 ∶55)和乙腈 － 水(50 ∶50)]、色谱柱温度(25，30，35 ℃ )、流动相流速(1.0，1.2 mL/min)，其余条件照系统适应性的条件进行试验。结果表明，含量测定方法条件变化较小时，TAP和其他峰能很好分离且含量变化不大。

2.4 样品测定

样品含量测定:精密称取TAP对照品和TAP样品(3批)适量按系统适应性的色谱条件进行含量测定。结果批号分别为091221，100118，100308 的样品，纯度分别为 98.65，98.76，98.88。

有关物质测定:采用自身对照法测定有关物质含量。精密量取本品适量，用流动相配制成含TAP约1 g/L的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液适量，用流动相稀释成含TAP约0.01 g/L的溶液，作为对照品溶液。取对照品溶液5 μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20%～25%，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的3倍。再精密量取供试品溶液与对照品溶液各5 μL，分别注入液相色谱仪进行测定，结果见表1。

表1 样品有关物质测定结果

3 讨论

取TAP、中间体A和B适量，加流动相稀释至适宜质量浓度，在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描。结果表明，TAP、中间体A和B均在250 nm附近有最大吸收，故选择250 nm为检测波长。

在流动相筛选过程中，笔者设计了乙腈－水(40∶60)、乙腈－水(35∶65)、乙腈－0.02%磷酸(40∶60)等多组流动相系统。试验结果表明，流动相为乙腈－水(45∶55)时，与其他峰能够达到完全分离，且主峰的出峰时间合适，故选择乙腈－水(45∶55)为流动相。

TAP在酸性、强光和氧化条件下比较稳定，在碱性条件下不稳定;降解产物结构需要在后续研究中采用液质等手段确定。

[1]郭冬艳，杨大坚，陈士林，等.葛根素及其衍生物在大鼠体内的药代动力学研究[J].陕西中医学院学报，2008，31(1):52－54.

[2]郭冬艳，宋浩亮，陈士林，等.葛根素及其衍生物抗心肌缺血心律失常的实验研究[J].辽宁中医药大学学报，2006，8(5):45－46.

[3]陈国庆，李恒华，张 毅，等.四乙酰葛根素在大鼠小肠中吸收特性的研究[J].中国新药与临床药理，2010，9(21):456－458.

[4]陈国庆，张 毅，翁代群，等.四乙酰葛根素在模拟人体胃肠环境中的稳定性研究[J].时珍国医国药，2010，21(7):1 709－1 710.

[5]张 毅，李恒华，江 兵，等.四乙酰葛根素对离体大鼠胸主动脉环作用初步研究[J].中国现代应用药学杂志，2009，26(11):873－875.