缬沙坦对家兔慢性冬眠心肌细胞中肝细胞生长因子水平和心功能的影响

徐瑞金 纪霞孙 元芬黎 霞潘茗

·基础研究·

缬沙坦对家兔慢性冬眠心肌细胞中肝细胞生长因子水平和心功能的影响

徐瑞金 纪霞孙 元芬黎 霞潘茗

目的观察缬沙坦对慢性冬眠心肌细胞中肝细胞生长因子(HGF)和心功能的影响。方法36只新西兰大白兔用简单随机抽样法分为3组:假手术组、慢性冬眠心肌组、缬沙坦组各12只。结扎冠状动脉左室支制备慢性冬眠心肌模型，在此基础上给予血管紧张素Ⅱ受体(AT1)的拮抗剂缬沙坦干预8周后，用多功能生理记录仪检测左心室功能，酶联免疫吸附法(ELISA)测定心肌组织中HGF含量，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞。结果与假手术组比较，慢性冬眠心肌组左心室功能减退，心肌组织中HGF含量降低［(2.99±0.57)ng/g组织比(5.16±0.64)ng/g组织，P＜0.01］;与慢性冬眠心肌组比较，缬沙坦组心肌组织中HGF含量升高［(4.65±0.72)ng/g组织比(2.99±0.57)ng/g组织，P＜0.01］，细胞凋亡指数降低(99.45± 17.32比120.129±15.97，P＜0.01)，且与心肌组织中HGF含量呈负相关(r=－0.666，P＜0.01)，缬沙坦可抑制慢性冬眠心肌组织间质纤维化，改善心功能(P＜0.01)。结论慢性冬眠心肌中HGF含量降低，缬沙坦可保护缺血心肌。

冬眠，心肌;肝细胞生长因子;细胞凋亡;缬沙坦

无论冠状动脉慢性缺血还是急性心肌梗死(AMI)都会有大量慢性冬眠心肌(CHM)产生，CHM的存在会引起心功能降低、心律失常、再梗死从而增加心血管事件的发生率，因此越来越受到人们的关注，寻求一种有效的干预措施对治疗缺血性心脏病具有重要的临床意义。肝细胞生长因子(HGF)是间质细胞衍生的一种能促进细胞有丝分裂的多功能因子，HGF存在于肝脏、肾脏等组织中。缬沙坦被证实可逆转心肌梗死及梗死后心力衰竭患者的心室重构，从而改善预后。但迄今为止有关缬沙坦对CHM作用的研究很少，其确切机制及对HGF影响国内尚无相关报道。本研究采用开胸不全结扎冠状动脉左室支的方法建立家兔CHM模型，探讨缬沙坦对CHM组织中HGF、间质纤维化及心功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新西兰大白兔36只，雌雄不拘，体质量2.2～2.8 kg，平均(2.5±0.3)kg，月龄5～6个月，由青岛医学院动物实验中心提供，经检疫证实为健康状态。1.2分组和试剂仪器

将36只新西兰大白兔按简单随机抽样法分为3组:假手术组、CHM组和缬沙坦组各12只。主要试剂仪器:缬沙坦(北京诺华制药有限公司，批号: x1269)，Maclab生理记录仪(澳大利亚ADI公司)，图像处理仪(美国GENE公司)，TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)试剂盒(北京中山生物技术有限公司)、羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 CHM模型制备

将动物称质量，耳缘静脉建立静脉通路，硫喷妥钠(30 mg/kg)静脉麻醉达满意状态，四肢反射及角膜反射消失后将家兔仰卧位固定于兔台上，30 min追加硫喷妥钠(30 mg/kg)以维持麻醉效果，将针形电极分别刺入实验动物右上下肢、左下肢连接Maclab/12s多功能生理记录仪行心电监护，沿胸骨正中切口开胸剪开心包暴露心脏，取冠状动脉左室支距主动脉根部约1.5 cm处为结扎点，用6/0的医用无创缝合针于左室支穿线不全结扎冠状动脉左室支中下部(假手术组只穿线不结扎)。造成靶血管重度狭窄，手术成功标准为其支配区主要为左心室下壁心肌颜色变淡，同时Maclab/12s多功能生理记录仪显示Ⅱ、Ⅲ、AVF导联出现ST段压低、T波倒置等心肌缺血表现(无ST段抬高等急性心肌梗死表现)，以0.9%生理盐水冲洗胸腔，放置引流条后关胸。术后1 d拔除引流条，青霉素80万U肌肉注射3 d，送回动物中心，除假手术组外，其他两组动物均予高脂喂饲(基础饲料+1%胆固醇+3%猪油)8周;并且缬沙坦组动物术后第2天开始予缬沙坦溶解在水中喂饲，每天2次至8周后再次开胸。

1.4 血流动力学测定

术后8周所有动物再次麻醉开胸并肝素化，于心尖部用5/0无创线做一直径为5 mm荷包，中心部插入1.5 mm带针芯检测管于左心室，拔出针芯后接检测管并连至能量转换器，接Maclab/12s多功能生理记录仪，5 min待心脏稳定后描记左心室功能指标，左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)、等容收缩期最大瞬间压力升高速率(+dp/dt)、等容舒张期最大瞬间压力下降速率(－dp/dt)，左心室发展压(LVDP)=LVSP－LVEDP。

1.5 组织生化

将动物处死，立即取出心脏，在结扎线下方2 mm处剪取心肌组织(假手术组心肌组织取自正常心室与梗死区相对应的部位)，放入冷冻管中置于液氮罐保存。检测时将心肌组织匀浆后，4000 r/min离心10 min，取上清液，酶联免疫吸附法(ELISA)检测心肌组织中HGF含量。用酶标仪在450 nm处读取数值，并根据标准曲线计算HGF含量。

1.6 凋亡细胞检测

采用TUNEL法检测凋亡细胞，具体操作步骤按说明书进行，细胞核染成棕褐色视为凋亡细胞。用Leica图像处理仪在400倍镜下选取6个视野测灰度值，细胞凋亡指数用灰度的差值表示。

1.7 心肌组织中羟脯氨酸含量检测

从液氮中取出冻存的心肌称取组织100 mg，先用眼科剪将心肌剪成碎沫放在匀浆管中，加入0.9%NaCl 0.9 ml用电动匀浆器高速匀浆15次(以上操作均在冰浴中进行)，匀浆后以3500 r/min离心10 min，取上清0.1ml加0.9%NaCl0.4ml稀释成2%的组织匀浆，再根据羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所)要求测定羟脯氨酸含量。

1.8 统计学方法

计量资料用均数±标准差(¯x±s)表示。采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，组间比较采用方差分析(ANOVA)和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 家兔心肌组织中HGF含量的变化

与假手术组心肌组织中HGF含量［(5.16± 0.64)ng/g组织］比较，CHM组［(2.99±0.57)ng/g组织］和缬沙坦组［(4.65±0.72)ng/g组织］降低(P＜0.01);与CHM组比较，缬沙坦组心肌组织中HGF含量升高(P＜0.01)。与假手术组心肌组织中羟脯氨酸含量［(0.306±0.015)ng/mg组织］比较，CHM组［(0.654±0.048)ng/mg组织］和缬沙坦组［(0.403±0.053)ng/mg组织］升高(P＜0.05);与CHM组比较，缬沙坦组心肌组织中羟脯氨酸含量降低(P＜0.05)。

2.2 缬沙坦对CHM家兔心功能影响

与CHM组比较，缬沙坦组LVDP、+dp/dtmax和－dp/dtmax升高(P＜0.01)，但低于假手术组(P＜0.05)，见表1。

表1 各组血流动力学指标测定(¯x±s)

2.3 心肌组织中凋亡细胞表达

假手术组心肌组织中可见少量凋亡细胞，细胞凋亡指数(12.46±3.13);CHM组和缬沙坦组可见较多凋亡细胞，细胞凋亡指数分别为(120.13± 15.97)和(99.45±17.32)，缬沙坦组显著低于CHM组(P＜0.01)，且与HGF含量呈负相关(r=－0.666，P＜0.01)，图1～3。

3 讨论

CHM是可逆性收缩功能异常的心肌，它的产生可造成左心室收缩功能持续性损害，而改善心肌灌注，可使其异常功能得到部分或完全恢复［1］。

HGF是间质细胞衍生的多功能细胞因子，是重要的营养因子，既往研究表明，HGF能防止和逆转肝脏、肺脏、肾脏组织损伤后的纤维化和具有抗细胞凋亡作用［2］。近年研究发现血管内皮、血管平滑肌细胞中也存在HGF及其受体(C-met)，并在心血管疾病的发生和发展过程中起重要作用［3-5］。

有研究成功地将携带HGF基因的慢病毒转染入内皮祖细胞(EPCs)中，协调EPCs和HGF促进血管再生和防止纤维化的作用，应用于缺血性心脏病的临床治疗［6］。血管紧张素受体阻断剂(ARB)类药物对缺血心肌的保护近年来引起了人们的关注。本研究发现，CHM组较假手术组心肌组织中的HGF含量降低，局部组织中的HGF受到血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的调节，慢性心肌缺血后，心肌组织中的AngⅡ增高，AngⅡ可与HGF基因5'端驱动子序列中的AngⅡ抑制元件结合，下调心肌细胞、血管内皮、纤维细胞的HGF mRNA表达。本研究显示，与CHM组比较，缬沙坦组HGF升高，ARB类药物在受体水平上直接阻断AngⅡ，消除了AngⅡ对HGF的负调控作用，使HGF含量增高。发挥了抗细胞凋亡、促进血管再生作用［7-8］，从而逆转和防止左心室重构，改善心功能，实验结果显示缬沙坦组心功能有明显改善。另外，ARB类药物可以扩张动、静脉，减少回心血量，降低左心室舒张末期压力容积，降低肺血管阻力，减少心肌耗氧量，ARB类药物还增加冠状动脉血流，增加心肌氧供，此外，ARB类药物可以增强心脏收缩能力，增加心输出量，逆转肥大心肌。

心肌组织间质和血管周围成纤维细胞增生导致胶原合成增多是心肌纤维化的主要原因，羟脯氨酸是机体胶原蛋白的主要成分之一，在正常胶原蛋白中含量约13.4%，在弹性蛋白中含量极少，而在其他蛋白则不存在。因此，心肌组织中羟脯氨酸的含量可以反映胶原的蛋白表达水平，组织中羟脯氨酸含量可作为衡量其胶原组织代谢和判断纤维化程度的重要指标。本实验显示，缬沙坦组较CHM组心肌组织中羟脯氨酸含量明显减少，提示缬沙坦可抑制心肌纤维化，其环节可能包括:(1)直接抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统减少心肌胶原的合成。(2) Ca2+在AngⅡ致成纤维细胞合成胶原过程中起重要的介导作用，而缬沙坦可降低心肌组织Ca2+而减少胶原合成，适当降低的Ca2+可提高胶原酶活性，加速胶原降解。AngⅡ还可与其受体结合抑制细胞生长［8］，这种作用部分是由激活的蛋白酪氨酸激酶调节，蛋白酪氨酸磷酸酶可导致血管紧张素受体(ATR)或生长因子激动的丝裂素活化蛋白激酶失活。缬沙坦可在受体水平上抑制AngⅡ与ATR结合而发挥抑制心肌细胞凋亡的作用进一步改善心功能，本实验证实慢性冬眠心肌可造成左心室收缩功能降低，缬沙坦可改善左心室收缩功能。由于本实验未测定家兔心肌组织中AngⅡ及其受体的含量，故上述推测还有待于今后的实验进一步来证实。

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Effects of valsartan on hepatocyte grow th factor and left ventricular function in the rabbitmodel of chronic hibernating myocardium

XURui-jin，JIXia，SUN Yuan-fen，LIXia，PANMing.Departmentof Health Care，Municipal Hospital of Qingdao，Qingdao 266071，China

PAN Ming，Email:sdqdpm@163.com

ObjectiveTo study the effects of Valsartan on hepatocyte growth factor(HGF)and left ventricular function in the rabbitmodel of chronic hibernatingmyocardium.MethodsAtotal of 36 rabbits were random ly divided into three groups(12 in each group)，sham-group，chronic hibernatingmyocardium group and Valsartan group.The rabbitmodel of chronic hibernatingmyocardium was established by the left ventricle coronary artery ligation.HGF in chronic hibernatingmyocardium was determined by ELISA and cell apoptosis was detected by TUNEL.Valsartan group was given oral Valsartan for 8 weeks.Left ventricle hemodynamics wasmonitored by Maclab/12s multifunctional physiological dynamic instrument.Resu lts

Compared with sham-group，left ventricular function was decreased significantly and HGF was significantly lower［(2.99±0.57)ng/g tissue vs.(5.16±0.64)ng/g tissue，P＜0.01］in chronic hibernating myocardium group.HGF in Valsartan group was significantly higher［(4.65±0.72)ng/g tissue vs.(2.99 ±0.57)ng/g tissue，P＜0.01］than in chronic hibernatingmyocardium group.Themyocardial apoptotic cell in Valsartan group was significantly lower than in chronic hibernatingmyocardium group(P＜0.01)and was correlated negatively with HGF(r=－0.666，P＜0.01).ConclusionsThe content of HGF in chronic hibernatingmyocardium is low.Valsartan could protect ischemicmyocardium.

Hibernation，myocardial;Hepatocyte growth factor;Cell apoptosis;Valsartan

2012-05-11)

(本文编辑:谭潇)

10.3969/j.issn.1007-5410.2012.04.015

266071青岛市市立医院保健科

潘茗，电子信箱:sdqdpm@163.com