应用鸡胚心脏左心室射血分数评估扩张型心肌病患者自身抑制性抗体的研究

潘伟民 朱云云 许幼峰 陈晓敏 陈立斌 章朝霞 张盛敏 俞霏 孙定河 翁跃颂

·基础研究·

应用鸡胚心脏左心室射血分数评估扩张型心肌病患者自身抑制性抗体的研究

潘伟民 朱云云 许幼峰 陈晓敏 陈立斌 章朝霞 张盛敏 俞霏 孙定河 翁跃颂

目的使用心脏超声对鸡胚心脏左心室射血分数(LVEF)测定来评估扩张型心肌病心力衰竭患者是否存在心肌自身抑制性抗体。方法按随机数表法选取36例扩张型心肌病心力衰竭患者和23例冠心病心力衰竭患者的IgG血清，滴入18d胚龄的鸡胚中，用超声心动图仪检测鸡胚心肌抑制状况。结果冠心病心力衰竭组LVEF为81.03%±2.67%，扩张型心肌病心力衰竭组中，心肌自身抑制性抗体阴性13例，其LVEF为81.24%±2.33%，而抗体阳性23例(63.9%)，其LVEF为62.04%±2.98%。结论扩张型心肌病心力衰竭患者中可能存在心肌抑制性抗体。

扩张型心肌病;心力衰竭;心肌抑制性抗体;鸡胚;心脏超声

扩张型心肌病是一种以左心室或双心室舒张及收缩功能障碍为特征的原发性心肌病。目前虽有β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)或心室再同步疗法可缓解部分患者的症状，但多数患者最终因心力衰竭而死亡。近年来扩张型心肌病心力衰竭的原因被认为与自身免疫反应有关，针对其发病机制的免疫吸附疗法正在受到关注。但重要的是必须首先确定哪些患者体内存在心肌抑制性抗体。本研究试图使用心脏超声对鸡胚心脏左心室射血分数(LVEF)测定来评估患者体内是否存在心肌抑制性抗体。

1 对象和方法

1.1 研究对象

本研究入选了36例扩张型心肌病和23例冠心病心力衰竭的住院患者。扩张型心肌病的诊断按照2008年世界卫生组织/国际心脏病学会与联合会(WHO/ISFC)的标准，冠心病均通过冠状动脉造影明确诊断，心力衰竭诊断按2007年版《慢性心力衰竭诊断治疗指南》的标准。在入选时，所有患者均有心力衰竭症状，纽约心功能分级(NYHA)Ⅲ～Ⅳ级，用心脏彩超双平面改良Simpson法确定LVEF＜45%。

1.2 方法

1.2.1 血清IgG提纯所有入选对象均被抽取血清保存于－80℃冰箱内。当标本备齐后，取冰冻血清温水解冻，应用中科晨宇生物科技提供的抗体纯化试剂盒来提纯血清IgG，步骤如下:(1)将抗血清低温15 000×g离心5 min，最上层有漂浮物，最下层有沉淀，取中间层;(2)振荡悬匀Protein A Sepharose 4 EF;(3)加190～200μl(50%)Protein A Sepharose 4 EF悬液到小离心柱，去掉Tip的尖端; (4)加500μl相应的平衡缓冲液到小离心柱，800× g离心1 min;(5)将稀释的样品加入小离心柱，加盖，翻转混匀Protein A Sepharose与样品，重复翻转5 min，以使Protein A Sepharose与样品充分结合，500×g离心1 min;(6)加500μl相应的平衡缓冲液到小离心柱，800×g离心1 min;(7)加400μl相应的洗脱缓冲液，800×g离心5 min;(8)为保持抗体活性，洗脱品立刻加入20μl中和缓冲液。将收集的IgG液测定其蛋白含量、活性和纯度，确定每份血清标本的IgG含量至少为1 mg，然后低温保存备用。

1.2.2 鸡胚试验检测心肌抑制性抗体取孵化18 d胚龄的海兰白胚蛋(慈溪市益大禽业有限公司)做心脏彩超，首先在鸡胚卵圆空气囊端打1小洞(直径约2 mm)，滴入麻醉剂10 min后将患者血清提纯的IgG (或生理盐水)加入卵圆空气囊(1.0 mg/egg)。20 min后，在卵圆空气囊区用小血管钳仔细剥去空气囊端的蛋壳，超声探头从此洞探测鸡胚的心脏搏动(超声仪型号:GE Vivid 7-12L，探头频率:13 MHz)。用M超来重复测定左心室舒张期内径(LVDd)、左心室收缩期内径(LVDs)、左心室缩短分数(LVFS)、LVEF及心率(至少测3次取平均值)。本研究将鸡胚按随机数表法分为生理盐水组(39例)、扩张型心肌病组(DCM组，36例)及冠心病心力衰竭组(non-DCM组，23例)。non-DCM组研究对象的年龄、性别、LVEF值均与DCM组相匹配。首先确定生理盐水组鸡胚的LVEF均数±SD，存在心肌抑制性抗体定义为LVEF低于均数－2SD。预实验显示，IgG未被细胞因子或神经体液因子包括白介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、去甲肾上腺素或尿钠肽所污染。

1.2.3 N末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)水平的测定血清NT-proBNP检测采用定量ELISA改进法［1］，试剂盒(Biomedica公司，奥地利)，仪器为ST-360多功能酶标仪(上海科华)。

1.3 统计学方法

计量资料用均数±标准差(¯x±s)表示，计数资料用百分构成比表示。用SPSS 18.0统计软件进行数据统计，组间比较，计数资料用χ2检验，两组之间的均数比较用独立t检验，多组之间的均数比较采用方差分析(F检验)，经F检验有统计学意义，再进一步行多重比较，本研究采用Dunnett-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扩张型心肌病心肌抑制性抗体阳性患者的临床特征

心肌抑制性抗体阳性(DCM+)和阴性(DCM－)两组患者的年龄、性别、LVEF及NT-proBNP差异均无统计学意义(均为P＞0.05)(见表1)。LVEF和NT-proBNP测定均在抽血测心肌自身抗体的1周内完成。

表1 两组扩张型心肌病心力衰竭患者的临床特征

2.2 各组鸡胚心脏彩超指标比较

LVDD在各组之间差异无统计学意义(F= 1.58，均为P＞0.05)，而LVDS、LVEF、LVFS及心率在各组间差异有统计学意义(F值分别为3.10、3.81、3.76、3.21，均为P＜0.05)，本研究进行了各组均数之间的多重比较(Dunnett-t检验)，结果提示，较之生理盐水组，non-DCM组以及DCM－组中各数据差异并无统计学意义(均为P＞0.05)，而DCM+组中，LVDD与生理盐水组差异无统计学意义(P=0.345)，但LVDS、心率均显著高于生理盐水组(P=0.016，P=0.024)，LVEF、LVFS均显著低于生理盐水组(P=0.019，P=0.012)。见表2、图1～2。

表2 各组鸡胚心脏彩超的测定值(¯±s)

表2 各组鸡胚心脏彩超的测定值(¯±s)

注:与生理盐水组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

组别例数LVDD(mm)LVDS(mm)LVEF(%)LVFS(%)心率(次/min)生理盐水组39 0.32±0.06 0.19±0.04 82.20±3.25 47.41±3.11 126.83±13.65 non-DCM组23 0.31±0.05 0.19±0.03 81.13±2.67 46.65±3.11 128.29±15.57 DCM－组13 0.31±0.05 0.20±0.04 81.14±2.33 46.04±2.98 130.17±20.65 DCM+组23 0.31±0.06 0.22±0.02a62.04±2.98b31.12±3.00b141.38±24.67a

3 讨论

扩张型心肌病的病因尚未完全阐明，可能是以遗传基因为基础，由病毒感染诱发的自身免疫性疾病，最终可导致严重心力衰竭。目前认为部分扩张型心肌病与自身免疫有关，患者体内的体液免疫异常可能起了重要的作用。许多证据表明，患者血清中存在抗心肌抗体，这类抗体多数为β受体抗体和M2受体抗体［2-4］，清除这种心肌抑制性抗体，可能改善心功能。基于这种认识，一系列免疫相关疗法已试用于临床，例如免疫吸附疗法、血浆置换疗法、免疫抑制疗法等等［5-6］。

其中免疫吸附治疗是目前免疫治疗中最主要的形式。然而并非所有扩张型心肌病患者均适合做免疫吸附治疗［7］，只有治疗前心肌抑制性抗体阳性的患者采用该疗法有效，反之疗效不佳，因此选择哪种扩张型心肌病患者对于做免疫吸附治疗疗效至关重要。患者是否存在心肌抑制性自身抗体，在临床上无法判定［8］。即使用培养心肌细胞的测定也不能作为免疫吸附治疗的筛选方法，仅仅是因为重症患者就使用免疫吸附疗法的话，治疗无效的病例将会增加。日本在世界上首先建立简便有效的体外实验［6］。他们将患者血清加入鸡受精卵后用心脏超声测定鸡LVEF，若存在心肌自身抑制性抗体，LVEF则下降。104例扩张型心肌病患者的测定结果表明65.9%存在心肌自身抑制性抗体［6］。

我们用心脏超声测得的生理盐水组LVEF值均数±2SD作为正常范围，发现冠心病心力衰竭组不存在心肌抑制性抗体，对鸡胚心脏LVEF无抑制作用，与生理盐水组相同。而36例扩张型心肌病心力衰竭患者中有23例(63.9%)患者血清IgG对鸡胚心脏LVEF有抑制作用，明显低于生理盐水组和冠心病心力衰竭组(P＜0.01)，与日本报道的相似。提示这些患者可能通过吸附体内的心肌抑制性抗体，减少其对心肌的免疫损伤，使心功能获得改善。而在本研究中扩张型心肌病的心力衰竭患者是否存在心肌抑制性抗体，无论在年龄、性别和心力衰竭的严重程度上，两组差异均无统计学意义。

本研究还发现心肌抑制抗体阳性的扩张型心肌病组鸡胚的心率也明显高于心肌抗体阴性组，提示该抗体除了对心肌收缩功能有明显影响外，对鸡胚心脏的β受体也有作用，但不能排除心室率增快与LVEF降低有关。

本研究选择18 d龄的鸡胚用作检测是否存在抗心肌抗体。首先是因为心肌抑制性抗体属于IgG类抗体，可以透过鸡胚卵圆空气囊的半透膜进入鸡胚的血液循环，抑制鸡胚心脏的收缩功能。其二是由于18 d龄的鸡胚各个脏器已经发育成熟，心脏的舒缩在超声下清晰可见，时间过早鸡胚尚未成熟，鸡胚心脏难以测定，过晚鸡胚开始破壳进行肺呼吸而影响心脏超声检测。此外，鸡胚来源充足，价格低廉，鸡胚心脏抑制实验操作简单，无需特殊设备或条件，而且重复性好。

鸡胚心脏抑制试验可用作免疫吸附治疗前确定扩张型心肌病患者是否存在心肌自身抑制性抗体的筛选方法，也可作为免疫吸附治疗后心肌抑制性抗体是否转阴的简便易行检测方法。

［1］Wang LM，Chen QS，Xia F．Enzyme-linked immunosorbentassay for the quantitative determination of N-terminal pro-brain natriuretic peptide in serum and its clinical application．JMod Lab Med，2007，22:19-21．(in Chinese)汪隆海，陈启松，夏芳．N末端脑钠肽的定量ELISA法测定与临床应用．现代检验医学杂志，2007，22:19-21．

［2］Hare JM．The dilated，restrictive，and infiltractive cardiomyopathies．In:Libby，Bonow RO，Mann DL，Zipes DP，ed．Braunwald's Heart Disease，8th ed，W．B．Saunders，Philadelphia，2008，p1746．

［3］Okazaki T，Tanaka Y，Nishio R，et al．Autoantibodies against cardiac troponin I are responsible for dilated cardiomyopathy in PD-1-deficientmice．Nat Med，2003，9:1477-1483．

［4］Jahns R，Boivin V，Hein L，et al．Direct evidence for a beta aadrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy．J Clin Invest，2004，113: 1419-1429．

［5］馬場彰泰，村山章，若林靖久．拡張型心筋病患者の免疫吸着療法に有效な吸着カラムの同定．日本マフェレシス学会杂志，2004，23:101-102．

［6］Baba A．Autoantigen estimation and simple screening assay against dilated cardiomyopathy．Ther Apher Dial．2008，12:109-116．

［7］Wallukat G，Reinke P，Dorffel WV，et al．Removal of autoantibodies in dilated cardiomyopathy by immunoadsorption．Int JCardiol，1996，54:191-195．

［8］Liu PP，Schultheiss HP．Myocarditis．In:Linbby P，Bonow RO，Mann DL，Zipes DP，ed．Braunwald's Heart Disease，8th ed，W．B．Saunders，Philadelphia，2008:1790．

Evaluation of chickembry osleftventr iculare jectionf ractionf or detecting cardiode pressant autoantibodies inpatients with dilatedcardiomy opathy

PANWei-min1，ZHUYun-yun1，XUYou-feng2，CHENXiao-min1，CHENLi-bin2，ZHANGZhao-xia1，ZHANGSheng-min2，YUFei2，SUNDinghe3，WENGYue-song3.1Department of Cardiology，Ningbo FirstHospital，Ningbo315010，China;2 Department of Ultrasound;3Department of Laboratory Medicine

PANWei-min，Email:weimin-pan@sinacom

ObjectiveTodete ctcardiod epressant autoant ibodies inpatients with dilated cardiomyopathy(DCM)and heartfailure(HF)bychickembry osleftventricul are jection fraction(LVEF) evaluation.MethodsThirty-sixpatient with DCM and HF(DCMgroup)and 23coronary heartdisease patients with HF(non-DCMgroup) wereenrolled. Cardiode pressant antibodies weredeter minedby chick embryo LVEF evaluation afteradding thepatients'purified immunog lobulin Gto18-day-oldchickembryos.ResultsMean LVEFinnon-DCMgroupwas81.03%±2.67%.Mean LVEF of 13cases in DCM group with negativeantibody was 81.24%±2.33% and 62.04%±2.98% of 23cases in DCM group with positive antibody.ConclusionsCardiodepressant antibodiesmay bepresentin 63.9% of thepatients with DCM.

Dilatedcardio my opathy;Heart failure;Cardiode pressant autoantibody;Chick embryo;Ultrason icechocar diography

2012-02-28)

(本文编辑:周白瑜)

10.3969/j.issn.1007-5410.2012.04.014

宁波市自然科学基金项目(2009A610178)

315010宁波市第一医院心内科(潘伟民、朱云云、陈晓敏、章朝霞)，超声科(许幼峰、陈立斌、张盛敏、俞霏)，检验科(孙定河、翁跃颂)

潘伟民，电子信箱:weimin-pan@sina．com