阿司匹林或氯吡格雷作用下血小板不同活化途径的反应特点

李健 曹剑 王成彬 王华忠 贾冠洲 莫亚明 丛玉隆

·临床研究·

阿司匹林或氯吡格雷作用下血小板不同活化途径的反应特点

李健 曹剑 王成彬 王华忠 贾冠洲 莫亚明 丛玉隆

目的探讨阿司匹林和氯吡格雷抑制血小板环氧酶(COX)-1途径和P2Y12受体活化的特点及两途径之间的交互关系。方法20例健康男性志愿者按随机数余数分组法平均分为两组，分别服用阿司匹林(100mg/d)和氯吡格雷(75mg/d)连续7 d。并在服药和停药后第1、3、5、7天分别应用血栓弹力图、血小板功能分析仪和流式细胞仪观察血小板的抑制情况。结果服药后，氯吡格雷组的胶原-肾上腺素激活的闭孔时间(CEPI-CT)和胶原-腺苷二磷酸闭孔时间(CADP-CT)的变化差异均有统计学意义(F=27.2，P＜0.01，F=25.3，P＜0.05)，阿司匹林组CEPI-CT迅速增至检测上限300 s，差异有统计学意义(F=36.7，P＜0.01)，而CADP-CT变化差异无统计学意义(F=2.12，P= 0.13)。服药后阿司匹林组血小板COX-1途径抑制率增高至91.7%±0.9%(F=35.1，P＜0.01)，氯吡格雷组P2Y12受体抑制率由47.8%±3.1%增高至81.3%±3.8%(F=24.8，P＜0.01)，COX-1未受到有效抑制(F=1.85，P=0.11)。服药后两组CD62p表达降低50%(氯吡格雷组:F=28.7，P＜0.01;阿司匹林组:F=20.7，P=0.02)。结论花生四烯酸诱导的COX-1途径活化与P2Y12受体活化可能存在交互作用，床旁即时检验有助于快速了解血小板功能状态，为监测有效的联合用药提供依据。

血小板;阿司匹林;氯吡格雷;即时检验

血小板活化作为血栓形成中主要的始动因素在正常止血和病理凝血过程中发挥着重要作用，抗血小板药物的应用也日益成为预防心肌梗死、脑卒中等心脑血管疾病和介入治疗的焦点;特别是所谓“药物抵抗”现象受到广泛关注以来，血小板功能监测备受瞩目。为此，本研究应用床旁即时检验系统血小板功能分析仪PFA-100和血栓弹力图两种新方法结合流式细胞术，对健康个体进行阿司匹林和氯吡格雷作用下的血小板功能分析，以期发现花生四烯酸(AA)诱导的环氧酶(COX)-1途径和二磷酸腺苷(ADP)活化的P2Y12受体受抑制的反应特征。

1 对象和方法

1.1 研究对象

本院医生和工勤人员20名，入选标准:健康成年男性志愿者年龄23～39岁，平均(31.0±5.3)岁，红细胞压积在30%～50%之间，血小板计数(100～300)×109/L，C反应蛋白(CRP)＜8 mg/L。排除标准:出血性疾病史;消化道溃疡病史;既往严重高血压史(收缩压200 mm Hg或舒张压≥120 mm Hg);妊娠期妇女，高度怀疑主动脉夹层或动脉瘤，肝肾功能障碍;接受口服华法林抗凝治疗。按随机数余数分组法分为两组，10例服用阿司匹林肠溶片(拜阿司匹林片，德国拜耳制药，批号:BG04765)，连续7 d，100 mg/d，另外10例服用氯吡格雷片(波立维，法国赛诺菲安万特，批号:1A500)，连续7 d，75 mg/d，每次均监督服药。分别在服药前，服药和停药后第1、3、5、7天抽血送检。除1例服用阿司匹林者有轻度牙龈出血外，未见其他不良反应。本方案经伦理审查批准，并签署知情同意书。

1.2 方法

检测当天下午采集受试者静脉血，使用内含肝素锂和0.109 mol/L枸橼酸钠(1∶9)的试管(BD公司，美国)抗凝，血小板功能分析在采血后3 h内全部完成。

分别使用胶原-肾上腺素反应杯(collagen/ epinephrine，记为CEPI)和胶原-腺苷二磷酸反应杯(collagen/adenosine-diphosphate，CADP)在PFA-100 (DADE Berhing，德国)中检测受试者抗凝标本，记录血小板黏附和聚集时堵塞微孔所需的时间(closure time，CT)。CEPI-CT和CADP-CT的参考范围分别为(82～150)s和(62～100)s。

利用血栓弹力图仪Thrombelastograph 5000 (TEG，Haemonetics公司，美国)分别测定最大振幅(maximum amplitude，MA)、纤维蛋白凝集力(MAA)、ADP和AA诱导的血小板凝集力(MAAA和MAADP)，从而计算出全血条件下AA或ADP途径的抑制率{［1－(MA－MAAA/ADP)/(MA－MAA)］× 100%}。各主要指标的参考范围分别为反应时间(R):2～8 min、加速时间(K):1～3 min、加速角(Angle):55～78度、MA:51～69 mm。

使用配套试剂在FACSCalibur流式细胞仪(BD公司，美国)上测定血小板活化标志物CD62p的活性。

上述3种方法根据制造商建议和目前研究的通行办法，使用未服抗血小板制剂的健康人血标本进行质控，通过后进行测试。

为了消除炎症反应［1］和血液流变学对研究结果的影响，服药前后分别测定了受试者的白细胞计数(WBC)、CRP和全血黏度。WBC在XT-4000i血细胞分析仪(Sysmex公司，日本)上使用原厂配套试剂完成，CRP在BNⅡ特种蛋白分析仪(Siemens公司，德国)使用原厂hs-CRP试剂测定，全血黏度在SA-6000全自动血液流变分析仪(赛科希德公司，北京)上检测。在1、5、30、200(S－1)四个切变率下男性全血黏度的参考区间(mPa·s)分别为:17.60～21.35、8.31～9.95、5.18～5.94和3.53～4.65，每天质控通过后再行检测。

1.3 统计学方法

计量资料用均数±标准差(¯x±s)表示，计数资料用百分构成比表示。用SPSS 12.0统计软件进行数据统计，组内用药前后WBC、CRP和全血黏度的比较用配对t检验，组间比较计量指标用方差分析，用一般线性模型(general linearity model)分析各时间点血小板抑制率或闭孔时间的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血液学基本参数调查

受试对象的WBC、CRP和全血黏度在服药前后的差异无统计学意义(见表1)。

2.2 CEPI-CT和CADP-CT

阿司匹林组服药3 d后，CEPI-CT全部超过检测上限300 s，停药第7天仍处于较高水平，CEPI-CT随时间变化有统计学意义(F=36.7，P＜0.01);CADP-CT未超出参考区间，变化不显著(F=2.12，P=0.13)(图1)。

表1 受试前后各组WBC、CRP和血液黏度的比较(¯x±s)

图1 服用阿司匹林或氯吡格雷受试组CEPI-CT和CADP-CT的变化趋势

2.3 AA和ADP诱导聚集受抑制的情况

阿司匹林组服药后AA诱导聚集的抑制率增高至91.7%±0.9%，停药后迅速下降至18.6%± 3.5%，变化差异有统计学意义(F=35.1，P＜0.01)。氯吡格雷组服药后ADP诱导的聚集率由47.8%±3.1%增高至81.3%±3.8%，差异有统计学意义(F=24.8，P＜0.01)，AA诱导聚集的变化无统计学意义(F=1.85，P=0.11)(图2)。

图2 服用阿司匹林和氯吡格雷受试组血小板抑制率的变化趋势

2.4 CD62p的表达特征

服药7 d后氯吡格雷组CD62p的表达由24%± 12%降至12%±8%(F=28.7，P＜0.01)，阿司匹林组则由22%±9%降至10%±2%(F=20.7，P= 0.02)，均有统计学意义(图3)。

图3 两受试组CD62p在服药前后的变化

3 讨论

大量前瞻性研究表明阿司匹林抑制血小板活性的实际疗效需要监测。光学法血小板聚集率检测作为“金标准”受到诸多分析前影响因素(比如采血方法、抗凝剂种类、药物干扰和难于标准化等)和方法学本身(血浆提取和血小板数目等)的限制，临床应用尚不充分。这些干扰的不可预知性使临床迫切地需要更为理想、方便的检测技术［2］。PFA-100，TEG，VerifyNow和Sonoclot等床旁型即时检验设备的异军突起，为血小板功能监测和指导临床治疗带来了新的曙光。

PFA-100血小板功能分析仪的闭孔时间综合性地反映了包括聚集在内的多种血小板功能［3］，患者服用阿司匹林时通常表现为CEPI-CT延长，而CADP-CT变化不大［4］。本研究发现CADP-CT在用药和停药后有小幅波动，提示其他途径(如ADP活化)可能受到阿司匹林的间接影响。有学者认为PFA-100对氯吡格雷等P2Y12受体拮抗剂的疗效检测似乎不很敏感，笔者认为有必要从PFA-100的影响因素去理解:比如在高切变率条件下红细胞比积和血液黏度的差异作用，胶原的参与受到vWF水平的影响以及血小板水平的高低等。由于血小板抑制与CRP的潜在相关性［5］，本研究也测定了WBC、CRP和全血黏度，从结果看，受试期间这些因素不足以形成对结论的影响。

阿司匹林组服药后AA活化抑制率显著增高，提示100 mg阿司匹林能够有效抑制健康个体的COX-1活化，与PFA-100相似的是，TEG检出的ADP活化抑制也出现小幅波动。由于血小板活化时伴随着ADP的释放，ADP继而又激活血小板，所以存在着两个途径活化耦联的可能性，两者之间是否存在统计学相关性仍需进一步研究。氯吡格雷组在服药后存在COX-1抑制的减低趋势，也提示这种关联的存在;此外，也表明同时服用阿司匹林有利于有效抑制两个主要的活化方式，为联合用药提供了佐证。大部分药物耐受患者表现为稳定的血小板高活性特点［6］，不因用药时间和总量而变化，因此，在临床条件下选择一种具有足够灵敏度的监测手段显得尤为重要。通过对有限志愿者的研究，笔者认为尽管PFA-100和TEG能够有效表达血小板功能的变化，仍然需要选择合适的诱导剂才能特异性反映不同活化途径的情况。

虽然本研究显示服用氯吡格雷后CD62p表达减低，而且氯吡格雷也有抑制CD62p的作用，但是笔者认为，流式细胞术所用的20μmol/L ADP远远高于激活聚集所需的浓度(5μmol/L)，Geiger等［7］用5μmol/LADP刺激血小板观察CD62p，就未发现安慰剂与氯吡格雷之间的差异。高浓度ADP将产生非嘌呤诱导的次级反应，使血小板反应缺乏特异性，PLUTO-Stroke试验也提示CD62p可能不适于评价氯吡格雷对血小板的抑制［8］。

本研究利用PFA-100和TEG这两种新型床旁检验技术发现不同途径之间可能存在耦联关系或交互作用，从方法学上佐证了联合用药的优势，另一方面也为研究血小板活化提出了新的思路。虽然不同方法之间未必存在量化关系，但是两者之间的符合率和受试者的表现趋势是一致的，这是推广即时检验技术的前提;在利用快速便捷优势的同时，使用者也应充分了解各方法的潜在影响因素，杜绝片面结论的形成。

志谢衷心感谢李蕊女士和西门子公司提供支持

［1］Cheng T，Mathews KA，Abrams-Ogg AC，et al．Relationship between assays of inflammation and coagulation:a novel interpretation of the canine activated clotting time．Can J Vet Res，2009，73:97-102．

［2］Tantry US，Gurbel A．Assessment of oral antithrombotic therapy by platelet function testing．Nat Rev Cardiol，2011，8:572-579．

［3］Li J，Cong YL．The evolutional analysis and clinical application in hemoblast function．China Medical Device Information，2006，12:1-6．(in Chinese)李健，丛玉隆．血小板功能分析与止凝血检验进展．中国医疗器械信息，2006，12:1-6．

［4］Feuring M，Schultz A，Losel R，et al．Monitoring acetylsalicylic acid effects with the platelet function analyzer PFA-100．Semin Thromb Hemost，2005，31:411-415．

［5］Saltzman AJ，Mehran R，Hooper WC，et al．The relative effects of abciximab and tirofiban on platelet inhibition and C-reactive protein during coronary intervention．J Invasive Cardiol，2010，22:2-6．

［6］Jaitner J，Stegherr J，Morath T，et al．Stability of the high ontreatment platelet reactivity phenotype over time in clopidogreltreated patients．Thromb Haemost，2011，105:107-112．

［7］Geiger J，Teichmann L，Grossmann R，et al．Monitoring of clopidogrel action:comparison of methods．Clinical Chemistry，2005，51:957-965

［8］Serebruany VL，Malinin AI，ZiaiW，et al．Effects of clopidogrel and aspirin in combination versus aspirin alone on platelet activation and major receptor expression in patients after recent ischemic stroke:for the Plavix Use for Treatment of Stroke (PLUTO-Stroke)trial．Stroke，2005，36:2289-2292．

Responses of different platelet activation pathways to Aspirin/Clopidogrel adm inistration in healthy volunteers

LI Jian1，CAO Jian2，WANG Cheng-bin1，WANG Hua-Zhong1，JIA Guan-zhou1，MO Yaming1，CONG Yu-long1.1 Clinical Laboratory Center，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China;2 First Department of Geriatric Cardiology

CONG Yu-long，Email:hemthm@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the inhibition profiles ofaspirin and clopidogrel on COX-1 and P2Y12 receptor，and potential interaction between them.MethodsA total of 20 healthy male volunteers were admitted and divided into two groups，clopidogrel group(75 mg/d)or aspirin group(100 mg/d)in consecutive 7 days.Platelet inhibition(%)，CEPI-CT/CADP-CT and CD62p were detected and recorded beforemedicine administration and at the 1st，3rd，5thand 7thday after withdraw.ResultsBoth CEPI-CT and CADP-CT changed significantly(F=27.2，P＜0.01 and F=25.3，P＜0.01)after clopidogrel use. CEPI-CT was increased significantly to 300s after aspirin administration(F=36.7，P＜0.01)，but CADPCT showed no changes(F=2.12，P=0.13).Inhibition rate of COX-1 induced by arachidonic acid (inhibitionAA)was increased to 91.7%±0.9%(F=35.1，P＜0.01)after aspirin administraion.In clopidogrel group，P2Y12receptor inhibition rate was increased from 47.8%±3.1%to 81.3%±3.8%(F =24.8，P＜0.01).CD62p expression was decreased by 50%in both groups(clopidogrel:F=28.7，P＜0.01;aspirin:F=20.7，P=0.02).ConclusionsCOX-1 activationmay interactwith P2Y12 receptor in clinical settings and platelet function testing is useful for dual-therapy.

Platelet;Acetylsalicylic acid;Clopidogrel;Point-of-care test

2012-02-09)

(本文编辑:周白瑜)

10.3969/j.issn.1007-5410.2012.04.009

100853北京，解放军总医院临床检验中心(李健、王成彬、王华忠、贾冠洲、莫亚明、丛玉隆)，南楼心血管一科(曹剑)

丛玉隆，电子信箱:hemthm@yahoo.com.cn