粗壮脉纹孢菌发酵稻谷加工副产物生产类胡萝卜素培养基的优化

刘志刚，李 静，张丽美，邓泽元，范亚苇

（南昌大学，食品科学与技术国家重点实验室，高等研究院，江西南昌330047）

粗壮脉纹孢菌发酵稻谷加工副产物生产类胡萝卜素培养基的优化

刘志刚，李 静*，张丽美，邓泽元，范亚苇

（南昌大学，食品科学与技术国家重点实验室，高等研究院，江西南昌330047）

采用响应面法对粗壮脉纹孢菌发酵稻谷加工副产物（砻糠和脱脂米糠）生产类胡萝卜素的培养基进行了优化。通过Plackett-Burman设计法，研究了脱脂米糠、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4、MnSO4、CaCl2等6个因素对粗壮脉纹孢菌产类胡萝卜素的影响，筛选显著影响因素。然后通过响应面法优化发酵培养基组成。研究表明，脱脂米糠和（NH4）2SO4为类胡萝卜素发酵的主要影响因素。得到优化培养基为：脱脂米糠64.58%、砻糠33.85%、（NH4）2SO41.57%。在优化发酵工艺下，色素产量达到366mg/kg培养物。

类胡萝卜素，脱脂米糠，砻糠，粗壮脉纹孢菌，响应面法

Abstract：The culture medium composed of rice by-products（rice chaff and defatted rice bran） for carotenoid production by Neurospora crassa was optimized through statistical experiment design and data analysis.The defatted rice bran，（NH4）2SO4，KH2PO4，MgSO4，MnSO4and CaCl2were evaluated as factors affecting carotenoid biosynthesis by Neurospora crassa，and the significant factors were screened by a Plackett-Burman design.Then the culture medium was optimized by response surface methodology.Results indicated that defatted rice bran and （NH4）2SO4were the significant factors on carotenoid production.The optimal culture medium consisted of 64.58%defatted rice bran，33.85%rice chaff and 1.57% （NH4）2SO4at which the yield of carotenoids was gotten up to 366mg/kg culture using the optimized fermentation parameters.

Key words：carotenoid；defatted rice bran；rice chaff；Neurospora crassa；response surface methodology

类胡萝卜素（carotenoid）是一类呈黄色、橙红色或红色的多烯类物质，一般由8个类异戊二烯单位组成，包括胡萝卜素和叶黄素两大类色素。它是国际公认的具有生理活性的功能性色素，是人体及动物维生素A的重要来源；同时也是一类非常有效的抗氧化剂，对维持细胞正常生命代谢、增强人体免疫力、预防心血管疾病、延缓衰老和预防癌症具有重要价值。目前，类胡萝卜素作为功能性色素及营养强化剂已广泛应用于食品保健、饲料添加剂、医药及化妆品等领域[1-2]。近年来研究表明，天然类胡萝卜素较化学合成色素具有较高的安全性和生理活性，因此越来越受消费者的青睐。天然类胡萝卜素的生产主要有直接提取法和微生物发酵法。直接提取法主要以果蔬为原料，生产成本高、工艺复杂、提取效率低；而微生物发酵法因高效、操作方便、易实现工业化等优点受到人们的普遍关注，但普遍存在菌种易退化，培养基组成复杂，成本高等问题，因此积极开发简便高效的发酵工艺和廉价易得的原料是科研工作者目前研究的热点。本课题组在粗壮脉纹孢菌（Neurospora crassa）发酵再利用高纤维农副产品方面有一定研究。研究过程中发现，该菌固态发酵时可产生大量橙红色的分生孢子，并检测到其中含有类胡萝卜素[3]，国外也有类似报道[4-6]。但是相关报道都是关于粗壮脉纹孢菌产类胡萝卜素的机理和基础性研究，并未将其应用于实际类胡萝卜素的生产。另外，我国是世界上最大的稻谷生产国，稻谷加工副产物非常丰富，例如砻糠年产量在4000万t以上，米糠年产量在1000万t以上[7-9]，然而这些副产物的深度开发应用在我国处于较低水平，经济效益较低，造成了一定的资源浪费，所以本课题组拟采用砻糠和脱脂米糠作为发酵原料，对其进行开发和再利用。本研究拟采用响应面法对粗壮脉纹孢菌发酵稻谷加工副产物（砻糠和脱脂米糠）生产类胡萝卜素的培养基进行优化。通过Plackett-Burman设计筛选出对色素产量具有显著影响的因子，再通过最陡爬坡实验快速接近最大响应区域，最后用响应面法优化各主要影响因子以确定最佳发酵培养基组成，以期为稻谷加工副产物的开发利用提供了一条有效的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粗壮脉纹孢菌 本实验室自行筛选分离保存；砻糠、脱脂米糠 湖南粒粒晶粮油集团；丙酮 分析纯，上海科普化学试剂厂；乙酸乙酯 分析纯，天津市永大化学试剂有限公司。

紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；恒温恒湿培养箱 上海精宏实验设备有限公司；pH计 上海精科；手提式蒸汽灭菌器 上海申安。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基及培养条件

1.2.1.1 活化培养基 沙氏培养基（4%麦芽糖、2%蛋白胨、1.5%～1.8%琼脂，pH5.5～6.0）。

1.2.1.2 种子液的制备 葡萄糖10g、蛋白胨5g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O 0.5g、pH自然，自来水定容到1L。

1.2.1.3 培养条件 从新鲜菌体活化培养基上取1环菌接入种子液（30mL/250mL锥形瓶），于30℃、210r/min摇瓶培养24h后，以10%（v/m）的接种量接入固态发酵培养基，于30℃培养4d。

1.2.2 类胡萝卜素的提取及测定[3]菌体及孢子的破壁采用研磨破壁法。将上述培养好的培养物于45℃烘干36h达恒重，粉碎，备用。准确称取培养物1g，与2g石英砂及10mL丙酮∶乙酸乙酯（1∶1，v∶v）混合液充分研磨后，补足20mL丙酮∶乙酸乙酯（1∶1，v∶v）混合液后室温下浸提15min，将提取液滤入烧杯中。按上述操作，重复提取2次，合并提取液，减压蒸馏后用丙酮定容到15mL，经紫外可见分光光度计扫描后确定该色素的最大吸收峰在461nm处，因此于461nm下测定吸光度值，按下式计算类胡萝卜素含量。

类胡萝卜素产量（mg/kg培养物）=Aλmax×D×V/（0.16×W）

式中：Aλmax—类胡萝卜素最大吸收波长下的吸光度；V—提取所用溶剂量（mL）；D—测定试样时的稀释倍数；W—培养物重量（g）；0.16—类胡萝卜素的克分子消光系数。

1.2.3 实验设计

1.2.3.1 Plackett-Burman实验筛选培养基主要影响因素 影响粗壮脉纹孢菌产类胡萝卜素的因素较为复杂，参考余玮[10]、贾才华[11]等及本研究摸索，本实验选用实验次数N=12的Plackett-Burman实验设计，以砻糠和脱脂米糠为主要原料，选择脱脂米糠、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4、MnSO4、CaCl2六个因素为研究对象，另外选择3个虚拟项，用于估计误差，共9个因素，以类胡萝卜素产量为响应值，从中筛选出色素产量的主要影响因素。Plackett-Burman实验设计各因子及水平表见表1。

表1 Plackett-Burman实验设计因子水平表Table 1 Variables and levels in Plackett-Burman design

1.2.3.2 主要影响因素最陡爬坡实验 响应面拟合方程只在最佳值区域的紧接邻域里才能建立有效的响应面拟合。为了确定主要影响因素的最大响应区域，采用最陡爬坡法。最陡爬坡法以实验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最佳值区域。根据Plackett-Burman实验结果，可以选出2个主要影响因素，以类胡萝卜素产量为考察指标，设计最陡爬坡实验以快速接近最大响应区域。

1.2.3.3 响应曲面法（RSM）优化培养基组成 筛选出影响粗壮脉纹孢菌发酵稻谷加工副产物产类胡萝卜素的主要影响因子，并确定其最大响应区域后，采用旋转中心组合设计（central composite rotatable design，CCRD）法对脱脂米糠添加量（X1）和（NH4）2SO4添加量（X2）两个因素进行进一步优化，以获得该菌体产类胡萝卜素的最佳培养基。自变量xi按式（1）进行编码变换：

式中：Xi为自变量xi的编码值；xo为自变量xi在中心点的值；Δxi为自变量变化步长。

用标准多项式回归方法，对实验数据进行拟合，得到二次多项式回归方程：

式中：Y为预测响应值；β0为截距；βi为线性系数；βii为平方系数；βij为交互作用系数。

考察的变量及实验水平编码见表2。

表2 中心组合设计因素水平表Table 2 Variables and levels in central composite design

1.2.3.4 最佳发酵工艺下发酵生产色素实验 根据实验室先期优化的粗壮脉纹孢菌发酵稻谷加工副产物生产类胡萝卜素的最佳发酵条件（蒸料时间23min、培养基初始含水量56%、初始pH为培养基自然pH、接种量0.2%、种龄72h、发酵温度30℃、10cm高5W白炽灯全程光照培养112h），采用优化的培养基进行发酵生产色素实验，研究稻谷加工副产物发酵色素的可行性，为进一步中试生产提供基础数据。

1.2.4 统计分析 实验数据采用SAS 8.2软件进行统计分析，p＜0.05为显著性水平。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman实验筛选培养基主要影响因素

通过Plackett-Burman实验筛选出粗壮脉纹孢菌产类胡萝卜素培养基的主要影响因素，实验设计及结果见表3。

表3 Plackett-Burman实验设计及实验结果Table 3 Design matrix and experimental results of Plackett-Burman design

对Plackett-Burman实验结果进行回归分析，结果见表4。由表4可知，脱脂米糠（p=0.025486）、（NH4）2SO4（p=0.013161）均在95%概率水平上差异显著，而KH2PO4、MgSO4、MnSO4、CaCl2在95%概率水平上差异不显著。因此选择脱脂米糠和（NH4）2SO4进一步考察它们对类胡萝卜素产量的影响。其他可信度小的因素在下一步的培养基优化实验中不予考虑。

表4 Plackett-Burman实验结果回归分析Table 4 The results and regression analysis of the Plackett-Burman

2.2 最陡爬坡实验快速接近最大响应区域

由Plackett-Burman实验结果设计主要因素的最陡爬坡路径，其中脱脂米糠和（NH4）2SO4添加量均有显著正效应，应增加；根据这2个因素效应大小的比例设定它们的变化方向及步长进行实验，结果如表5所示，最优发酵条件可能在实验2与实验3之间，故以实验2的条件为响应面实验的中心点。

2.3 响应面法优化培养基组成

根据Plackett-Burman和最陡爬坡实验结果，选择脱脂米糠和（NH4）2SO4两个因素为自变量，以类胡萝卜素产量为响应值设计中心组合实验，实验设计及结果见表6。

表6 中心组合实验设计及响应值表Table 6 Process variables and levels in central composite design arrangement and experimental results

根据实验结果，利用SAS 8.2数学分析软件进行回归分析，得到响应曲面二次多元回归模型：Y=149.88+20.57541X1+5.075812X2-8.721269X12+19.525X1X2-23.37128X22式（3）

对模型进行方差分析，结果见表7，模型Pr＞F＝0.0001＜0.01，表明模型极显著，失拟项Pr＞F=0.930465＞0.1不显著，又有模型决定系数R2=0.9856，说明模型与实际情况拟合程度很好，因此该模型可用于粗壮脉纹孢菌发酵稻谷加工副产物产类胡萝卜素的最佳培养基组成的分析和预测。

表7 回归模型的方差分析Table 7 Variance analysis of each item in regression equation

由表7方差分析结果可知，各因素对粗壮脉纹孢菌发酵稻谷加工副产物产类胡萝卜素的线性效应、曲面效应、交互影响作用皆显著。脱脂米糠和（NH4）2SO4对类胡萝卜素产量的交互作用的响应曲面见图1。由图1可知，响应值Y随着X1编码值的增大呈现上升的趋势，而X2在编码值为1.0左右时有较大的响应值。同时，脱脂米糠和（NH4）2SO4之间的交互作用较显著，因素X1（脱脂米糠）对响应值的影响最大，这与方差分析的结果一致。

图1 脱脂米糠和（NH4）2SO4对类胡萝卜素产量交互作用的响应曲面图Fig.1 Response surface showing the interactive effects of defatted rice bran and（NH4）2SO4on carotenoid production

对培养基组成回归模型进行求导和解逆矩阵可以得到模型的极值点，脱脂米糠为64.58%，（NH4）2SO4为1.57%，砻糠为33.85%，此时模型预测的最大响应值为166.9mg/kg培养物。为了验证预测结果，在上述优化培养基条件下进行三次重复验证实验，得到类胡萝卜素产量为170.9mg/kg，与理论值接近。因此，通过响应面法优化的培养基参数准确可靠，具有一定的实际指导价值。

2.4 最佳发酵工艺下发酵生产色素实验

在1.2.3.4最佳色素发酵工艺下，色素产量为366mg/kg培养物。说明优化的工艺条件，能使色素产量进一步提高。

3 讨论与结论

3.1 稻谷加工副产物培养基组成简单

本研究发现，色素固态发酵最佳培养基由砻糠、脱脂米糠和少量的硫酸铵组成，该培养基可完全满足粗壮脉纹孢菌发酵色素的营养需求。硫酸铵作为一种速效氮源，主要用于满足菌体初期生长的营养需求。而其他相关研究报道中一般需要在培养基中添加参与菌体生长和物质代谢过程必需的矿质元素和无机盐，如磷酸盐、Ca2+、Mg2+、Mn2+等。米糠和脱脂米糠中含有丰富的矿物质，特别是磷（1.43%）和钙（0.07%），但大部分以植酸盐及其络合物的形式存在，这种植酸盐络合物的存在形式会降低米糠中有机磷和矿物质元素的生物利用率[12-13]。周小玲、刘友芬等研究发现[12，14]，粗壮脉纹孢菌能分泌植酸酶，植酸酶可催化分解植酸生成无机磷酸和肌醇，可解除植酸对金属离子和蛋白质的螯合作用，增加培养基中的可利用矿物质含量，并提高菌体对培养基中有机磷和矿质元素的利用率。因此，脱脂米糠中丰富的矿物质以及粗壮脉纹孢菌分泌的植酸酶可能是导致培养基不需添加无机盐的一个原因。

3.2 简单的固态发酵产较高产量的类胡萝卜素

在优化培养基和发酵条件下，粗壮脉纹孢菌类胡萝卜素的产量达366mg/kg培养物，该色素发酵工艺不仅培养基组成简单，原料廉价易得，而且采用固体发酵工艺，发酵周期短，过程易操作控制。与其他研究报道相比，该工艺在色素产量和发酵成本上均具有一定的优势。例如，赵峰梅等[15]研究光合细菌ZY2159菌株产类胡萝卜素的发酵条件，以苹果酸钠和酵母膏为培养液（需添加十二种无机盐）在5L发酵罐中培养6d，生物量可达15.4g/L发酵液，类胡萝卜素产量50.9mg/L发酵液；陈涛、陈宗胜等[16]利用三孢布拉氏霉生产β-胡萝卜素，以淀粉、黄豆饼粉、玉米浆和植物油为主要配方，在30L发酵罐中产量可达1213.1mg/L，在3m3发酵罐中产量可达1146.5mg/L；刘春朝[17]研究产类胡萝卜素的光合细菌Rhodobacter Sphaerordes在500L的发酵罐中48h时类胡萝卜素的产量可达295mg/L。P B Bhosale[18]对产β-胡萝卜素的Rhodotorula glutinis菌种发酵条件进行优化，采用UV对菌种进行诱变使总类胡萝卜素的产量达185mg/L。

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Optimization of culture medium composed of rice by-products for carotenoid production by fermentation of Neurospora crassa

LIU Zhi-gang，LI Jing*，ZHANG Li-mei，DENG Ze-yuan，FAN Ya-wei
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Institute for Advanced Study，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

TS210.1

A

1002-0306（2012）16-0277-04

2012－02－21 *通讯联系人

刘志刚（1984-），男，硕士研究生，主要从事发酵工程方面的研究。

食品科学与技术国家重点实验室基金项目（SKLF-MB-201003，SKLF-QN-201105）；江西省科技厅项目（2010BNB01104，S00344）。