蜂巢醋液态发酵工艺及其抗氧化活性研究

王振斌，孙 平，王 林，姜美花，夏 蓉

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013；2.江苏恒顺醋业股份有限公司，江苏镇江 212013）

蜂巢醋液态发酵工艺及其抗氧化活性研究

王振斌1，孙 平1，王 林1，姜美花1，夏 蓉2

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013；2.江苏恒顺醋业股份有限公司，江苏镇江 212013）

研究首次将蜂巢引入食醋的液态发酵工艺，优化获得了蜂巢醋液态发酵的最佳工艺条件：起始糖度5.33%，酵母活化液0.10%，酒精度5.0%，醋酸发酵温度35℃。在此条件下制备的蜂巢醋由于发酵原料和菌种单一，在可溶性固形物、总糖、香气、滋味等方面低于传统固态发酵产品，而在色泽、体态和风味典型性等方面较优。此外，该蜂巢醋DPPH自由基清除能力（33.29%）和总抗氧化能力（2252.63mmol·g-1）均显著低于固态发酵（66.25%，5092.63mmol·g-1）产品，这主要归因于和固态发酵峰巢醋总黄酮和总多酚（0.71%，2.33%）相比，液态发酵蜂巢醋总黄酮和总多酚含量（0.38%，1.20%）较低。

蜂巢醋，发酵工艺，抗氧化

Abstract：Honeycomb was used as raw material in the liquid fermentation of vinegar for the first time in this paper.The fermentation process was optimized and the optimum conditions was obtained：5.33%of initial sugar degree，0.10%of yeast activated liquid，5.0%of alcohol degree，35℃ of acetate fermentation temperature.Under the conditions，compared to solid-state fermentation the honeycomb vinegar was lower in soluble solids，total sugar，aroma，taste，but was higher in color，posture，flavor typicality.These results could be attributed to the single materials and strain in liquid fermentation of honeycomb vinegar.Moreover，DPPH radical scavenging activity（33.29%） and total antioxidant capacity（2252.63mmol·g-1） of the honeycomb vinegar by liquid fermentation were significantly lower than that of solid-state fermentation（66.25%，5092.63mmol·g-1），due to the lower content of flavonoids and polyphenol（0.38%，1.20%） compared to solid-state fermentation（0.71%，2.33%）.

Key words：honeycomb vinegar；fermentation technology；antioxidant activity

蜂巢（Honeycomb）是由蜜蜂的分泌物和采集物筑成的巢房，是蜂群生活、繁衍后代和贮存食物的场所，含有蜂蜜、蜂蜡、蜂花粉、蜂王浆、蜂胶、蜂毒、茧衣、幼虫分泌物等多种物质，营养丰富[1-2]。现代医学研究表明蜂巢具有抑菌、抗病毒、降血脂、抑制肿瘤、提高免疫等多种功效[3-7]。然而，目前蜂巢主要用于制备蜂蜡、蜂巢复合饮料和蜂巢素，研究利用较为落后。食醋是我国传统的酸性调味品，不仅含有丰富的营养成分，而且具有独特的药理作用，其生产主要基于固态或液态发酵。传统固态发酵生产周期长，劳动强度大；液态发酵周期短，产能大，劳动强度低，原料利用率高，是现代食醋生产的发展趋势[8-12]。本研究拟将蜂巢的营养功能成分引入食醋发酵过程中，优化液态深层发酵关键工艺参数，获得蜂巢醋生产的最佳生产条件，为蜂巢醋的研究开发和现代化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

蜂巢 由陕西咸阳选民养蜂场提供；酵母 安琪酵母有限公司；蔗糖 市售，纯度98%；醋酸菌 江苏恒顺醋业股份有限公司；VC、DPPH（二苯代苦味酞肪自由基）、TPTZ（三吡啶三吖嗪） Sigma公司。

HH.B11-600-S型恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；TU-1810型紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；DELTA320型pH计 上海梅特勒—托利多仪器有限公司；DSX-280A型不锈钢手提式灭菌器 上海三申医疗器械有限公司；WYT型手持糖度仪 成都光学厂。

1.2 实验方法

1.2.1 蜂巢醋发酵工艺优化

1.2.1.1 固态发酵 在镇江香醋传统固态发酵的基础上，以蜂巢提取液替代糯米浸渍用水，流程如下：蜂巢原料→解冻粉碎→20目过筛→超声波水浴提取（超声功率900W、超声时间15min、液料比（L/S）=100∶1）→离心→蜂巢水提液+糯米（L/S=2∶1）→浸渍、蒸煮、淋饭冷却→拌曲糖化、酒精发酵→加入醋酸菌发酵→淋醋杀菌→灌装保存[13-14]

1.2.1.2 液态发酵 液态深层发酵工艺流程如下：蜂巢水提液（1.2.1.1）+蔗糖→灭菌（60℃，30min）→加入酵母，酒精发酵→调酒精度、pH→加入醋酸菌发酵→淋醋杀菌→灌装保存[15-16]

1.2.2 蜂巢醋抗氧化活性评价

1.2.2.1 DPPH自由基清除率的测定 取0.5mL样品于试管中，加入1.0mL 0.1mmol·L-1DPPH溶液振荡摇匀，空白对照为95%乙醇，常温避光反应60min后于517nm测定吸光度，采用以下公式计算抑制率：

式中：Y：DPPH自由基抑制率（%），A0：空白对照吸光度，A：样品吸光度[17-18]。

1.2.2.2 总抗氧化能力的测定 采用FRAP法测定总抗氧化能力，取100μL样品于试管中，加入1.0mL FRAP工作液（0.3mol·L-1，pH3.6乙酸钠缓冲液、10mmol·L-1TPTZ溶液和20mol·L-1三氯化铁，以体积比10∶1∶1混和）混合均匀，37℃反应50min，于593nm测定吸光度[19-20]。

1.2.3 蜂巢醋感官评价 蜂巢醋感官评定评分标准如表1所示。

1.2.4 成分分析 总酸、还原糖、酒精度、可溶性固形物分别根据国标GB/T10345、GB/T15038、GB/T15038、GB2719测定；总黄酮和总多酚含量分别以芦丁、没食子酸为标样，采用分光光度法进行测定[21-22]。

1.2.5 统计分析 数据以三次独立样品测定的平均值±标准差表示；统计分析采用F检验，多重比较采用LSD法；p＜0.05被认定为存在显著性差异。

表1 蜂巢醋感官评定评分标准Table 1 Full score standards of sensory evaluation of honeycomb vinegar

2 结果与分析

2.1 蜂巢醋液态发酵工艺优化

2.1.1 起始糖度对蜂巢醋酒精发酵的影响 起始糖度对蜂巢醋的后续发酵具有重要的影响，一方面因为醋酸发酵需要较高的酒精度基础上才能稳定进行，因而必须有较高的起始糖度；另一方面，起始糖度也不可太高，否则会使得发酵醪中酒精度太高，会抑制醋酸发酵，同时由于挥发的原因而引起损失增加。蜂巢水提液的起始糖度为2.33%。在添加0.1%酵母液，发酵温度20℃的条件下，起始糖度对蜂巢醋酒精发酵的影响如图1所示。从图1可知，蜂巢水提液直接酒精发酵，发酵醪酒精度最高仅为2.5%，低于进入醋酸发酵的最小酒精度（3.5%），不利于后期的醋酸发酵。当起始糖度高于5.33%时，由于酵母对酒精的耐受性和氮源等营养物质限制，发酵醪的最终酒精度无显著差异。本实验选取以5.33%为制备蜂巢醋酒精发酵的初始糖度。

图1 起始糖度对蜂巢醋酒精发酵的影响Fig.1 Effect of initial sugar degree on alcohol fermentation of honeycomb vinegar

2.1.2 酵母添加量对液态发酵蜂巢醋酒精发酵的影响 在起始糖度为5.33%糖度，发酵温度为20℃的条件下，酵母添加量对液态发酵蜂巢醋酒精发酵的影响如图2所示。可以看出，酵母添加量为0.06%时，起酵时间长达3d，且最终的发酵醪酒精度较低（4.3%），这可能由于酵母添加量过低，酵母在发酵醪中先有氧繁殖后再无氧发酵，酵母繁殖消耗了发酵醪中的营养物质，使得酒精生成量降低。当酵母添加量高于0.10%时，起酵时间短，接种第1d酒精生成量就达到1.0%左右，第3d酒精发酵即结束，但最终酒精度却低于0.10%的酵母添加量。因此0.10%为最适宜的酵母添加量。

图2 酵母添加量对蜂巢醋酒精发酵的影响Fig.2 Effect of yeast activated liquid volume on alcohol fermentation of honeycomb vinegar

2.1.3 初始酒精度对蜂巢醋醋酸发酵的影响 在醋酸发酵温度为20℃的条件下，初始酒精度对液态发酵蜂巢醋醋酸发酵的影响如图3所示。初始酒精度对醋酸发酵有显著的影响，当初始酒精度低于5.0%时，起酵速度快，发酵时间短，但最终醋酸生成量较低；当起始酒精度高于5.0%时，起酵速度慢，发酵时间长，最终醋酸生成量与5.0%酒精度无显著差异。因此选取5.0%为醋酸发酵的起始酒精度。

图3 酒精度对蜂巢醋醋酸发酵的影响Fig.3 Effect of alcohol degree on acetate fermentation of honeycomb vinegar

2.1.4 发酵温度对蜂巢醋醋酸发酵的影响 在起始酒精度5.0%的条件下，醋酸发酵温度对醋酸发酵的影响如图4所示。当发酵温度为45℃时，醋酸起酵速度最快，但最终醋酸浓度最低，其原因可能是在较高温度下，醋酸发酵速度快，醋酸挥发速度也快，同时糖与蛋白质发生褐变反应的速度增加，部分糖不再转化为酒精和醋酸，最终的发酵醪颜色较深，醋酸浓度较低[23]；当发酵温度为25、30℃时，发酵速度较慢，发酵时间长达10d，最终醋酸度较高，但是发酵醪颜色较浅，香气较淡。因此，选取35℃为醋酸发酵的适宜温度。

综上所述，液态发酵制备蜂巢醋的最佳工艺条件为：起始糖度5.33%，酵母活化液0.1%，酒精度5.0%，醋酸发酵温度35℃。

图4 温度对蜂巢醋醋酸发酵的影响Fig.4 Effect of temperature on acetate fermentation of honeycomb vinegar

2.2 蜂巢醋成分分析与感官评价

在此条件下发酵蜂巢醋理化成分和感官评定结果如表2所示。可以看出，液态发酵蜂巢醋在可溶性固形物、总糖、香气、滋味等方面低于固态发酵，而在色泽、体态和典型性方面明鲜优于固态发酵，其原因在于固态发酵采用糯米为原料，营养成分丰富，因而产品固形物和总糖含量高；固态发酵法时间长，菌群丰富多变，产品香气和滋味亦较好；液态发酵以蜂巢水提液和蔗糖为主要原料，成分简单，因而其风味典型性强。

2.3 蜂巢醋抗氧化活性评价

2.3.1 DPPH自由基清除率与总抗氧化能力 DPPH是一种稳定存在的自由基，其乙醇溶液显紫色，在517nm处有最大吸收，当有供氢能力的抗氧化剂（如多酚）加入到其中时，和DPPH的单电子产生配对，使其在517nm处的吸收消失，吸光值越小说明抗氧化剂清除DPPH自由基能力越强[17-18]。本研究以VC为阳性对照，采用DPPH自由基清除能力分别评价了镇江香醋、蜂巢水提液、液态发酵蜂巢醋、固态发酵蜂巢醋的抗氧化活性，结果如图5所示。

图5 蜂巢醋DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH radical scavenging activity of honeycomb vinegar

FRAP法是评价总抗氧化能力的常用方法，其原理是在酸性条件下抗氧化物可以还原Ferrictripyridyltriazine（Fe3+-TPTZ）产生蓝色的Fe2+-TPTZ，在593nm测定Fe2+-TPTZ的吸光值即可获得样品的总抗氧化能力，并且可以抑制内源性的一些干扰因素[19-20]，结果如图6所示。

表2 蜂巢醋成分分析与感官评价Table 2 Component analysis and sensory evaluation of honeycomb vinegar

图6 蜂巢醋总抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of honeycomb vinegar

从图5和图6可以看出，该液态发酵蜂巢醋DPPH自由基清除能力（33.29%）和总抗氧化能力（2252.63mmol·g-1）均显著低于固态发酵（66.25%，5092.63mmol·g-1）产品。各样品抗氧化能力由高到低依次为：固态发酵蜂巢醋＞VC＞镇江香醋＞蜂巢水提液＞液态发酵蜂巢醋。

2.4 蜂巢醋抗氧化成分分析

目前黄酮和多酚被认为是天然产物中主要抗氧化物质基础。为了进一步了解蜂巢醋的抗氧化活性物质基础，测定了其中的总黄酮和总多酚含量，结果如表2所示。液态发酵蜂巢醋黄酮和多酚含量（0.38%，1.20%）与镇江香醋无显著差异，表明蜂巢水提液和糯米对最终产品主要抗氧化物质的影响相同。另一方面，液态发酵蜂巢醋黄酮和多酚含量显著低于蜂巢水提液（0.54%，1.35%），固态发酵蜂巢醋黄酮和多酚含量（0.71%，2.33%）也明显低于镇江香醋和蜂巢水提液含量总和（0.99%，2.48%），这均说明在蜂巢醋发酵过程中，发酵醪中的黄酮和多酚被微生物部分消耗或转化。再者，液态发酵蜂巢醋黄酮和多酚含量仅为固态发酵蜂巢醋的一半左右，而前者抗氧化活性也仅约为后者的一半，说明蜂巢醋的抗氧化活性与其黄酮和多酚含量具有明显的相关性，黄酮和多酚是蜂巢醋的主要抗氧化物质基础。

表3 蜂巢醋中总黄酮和总多酚含量Table 3 Content of total flavonoids and total polyphenol in honeycomb vinegar

3 结论

3.1 优化获得了蜂巢醋液态发酵的最佳工艺条件：起始糖度5.33%，酵母活化液0.10%，酒精度5.0%，醋酸发酵温度35℃。在此条件下制备的蜂巢醋由于发酵原料和菌种单一，在可溶性固形物、总糖、香气、滋味等方面低于传统固态发酵产品，而在色泽、体态和风味典型性等方面较优。

3.2 蜂巢醋DPPH自由基清除能力（33.29%）和总抗氧化能力（2252.63mmol·g-1）均显著低于固态发酵（66.25%，5092.63mmol·g-1）产品，这主要归因于和固态发酵峰巢酸总黄酮和总多酚含量（0.71%，2.33%）相比，液态发酵蜂巢醋总黄酮和总多酚含量（0.38%，1.20%）较低。

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Liquid fermentation technology and antioxidant activity of honeycomb vinegar

WANG Zhen-bin1，SUN Ping1，WANG Lin1，JIANG Mei-hua1，XIA Rong2
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.Jiangsu Hengshun Vinegar Industry Co.，Ltd.，Zhenjiang 212013，China）

TS201.2

B

1002-0306（2012）16-0236-04

2012－01－04

王振斌（1975-），男，博士，副教授，主要从事食品生物技术方面的研究。

国家星火计划（2011GA690057）；镇江市科技支撑项目（NY201010）。