响应面法优化Ganoderma lucidum产漆酶种子培养基

赵世光，钱森和，张 焱，蔡为荣，王 陶

（1．安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖 241000；2．徐州工程学院食品（生物）工程学院，江苏徐州 221008）

响应面法优化Ganoderma lucidum产漆酶种子培养基

赵世光1，钱森和1，张 焱1，蔡为荣1，王 陶2

（1．安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖 241000；2．徐州工程学院食品（生物）工程学院，江苏徐州 221008）

以菌丝体生物量为指标，采用响应面法对产漆酶的灵芝菌UIM281的种子培养基组成进行了研究。首先采用单因素实验确定影响UIM281菌丝体生长的碳源、氮源及无机盐的种类和浓度范围。在此基础上，应用Box-Behnken设计对影响菌丝体生物量的显著因素进行优化，最终建立了以菌丝体生物量为响应值的二次回归方程模型，获得了最适的菌丝体增殖种子培养基。结果表明，在VB10.1g/L的条件下最佳种子培养基组成为：玉米粉18.0g/L，豆饼粉12.3g/L，MgSO4·7H2O 1.8g/L，在28℃，150r/min条件下振荡培养6d后，可获得24.18g/L菌丝体，可为漆酶发酵培养提供质优量大的接种体。

灵芝菌，漆酶，种子培养基，优化，响应面法

Abstract：Targeting on mycelial biomass，response surface methodology（RSM） was applied to study the seeding medium components of UIM281，a Ganoderma lucidum strain producing laccase.Firstly，the categories and concentration scales of carbon source，nitrogen sources and inorganic salt affecting the growth of UIM281 mycelium were confirmed by single factor experiments.Based on this result，Box-Behnken design was used to optimize significant factors affecting mycelial biomass.Finally，the second-order equation model for mycelial biomass of UIM281 was established and seeding medium suitable to mycelial proliferation was obtained.The results showed when VB1was prior designated 0.1g/L，the optimal composing for seeding medium was as following：18.0g/L of corn flour，12.3g/L of soybean powder，1.8g/L of MgSO4·7H2O.When cultivated at 28℃and 150r/min for 6d，24.18g/L of biomass was obtained，which provided the excellent inoculum for the laccase fermentation.

Key words：Ganoderma lucidum；laccase；seed medium；optimization；response surface methodology

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在食品加工、造纸、废水处理等方面具有广泛的应用价值。灵芝菌（Ganoderma lucidum）除富含多糖、三萜类和肽类等有效生物活性成分外，也是产漆酶的重要真菌。在真菌漆酶发酵领域，高产菌株的选育、发酵工艺及产酶条件的优化已开展了很多研究[1-2]。漆酶发酵培养主要采用两种接种方式：一是采用从斜面或平板上挑取菌片直接接入发酵培养基进行漆酶发酵[3-4]，二是采用经种子扩培后再接入发酵培养基中进行产酶[5-6]；两类研究的重点多集中在发酵培养基及诱导产酶培养工艺的优化[7-8]。而真菌漆酶是在生产菌株菌丝体生长良好后被诱导分泌的次级代谢产物，在规模化发酵生产中，第一种接种方式会延长菌株在发酵培养基中的适应时间，造成部分营养物质被菌丝体生长而消耗，导致产酶时间推迟，发酵周期延长。而将斜面菌株经种子培养基增殖扩培后再接入发酵培养基中，则可实现生产菌株生长期和生产期的分离，可有效避免这种缺陷。响应面法（RSM）能够在有限的次数内，对影响生物过程的关键因子及其交互作用进行优化、评价，以获得影响过程的最佳条件，已成功应用于种子培养基以及发酵条件的优化[9-10]。本研究室利用离子注入手段选育出一株漆酶高产灵芝菌突变株UIM281，本文对影响UIM281菌丝体生长、增殖的碳源、氮源、无机盐种类及其浓度范围进行考察，采用响应面法对其营养条件进行优化，以期获得能够扩培出菌球均一、菌丝体生物量大的液体种子培养基，为进一步漆酶发酵提供质优量大的接种体，为漆酶工业化发酵提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种 灵芝菌UIM281由本实验室选育，4℃条件下保存于PDA斜面；斜面培养基（g/L） 马铃薯200，葡萄糖20，琼脂18，pH7.0；液体基础培养基（g/L） 葡萄糖20，蛋白胨10，KH2PO41，VB10.1，pH 6.0。

SHB-III循环水真空泵；TU-1800紫外-可见分光光度计；HZQ-F160恒温摇床；ZK-82A型电热真空干燥箱；TGLL-18K台式高速冷冻离心机；LDZX-40高压灭菌锅。

1.2 实验方法

1.2.1 种子摇瓶培养 从灵芝菌斜面切取黄豆粒大小菌块点种于PDA平板中心，28℃培养5～7d，至菌丝体长满2/3平板，挑选生长良好的平板，用打孔器切取直径1cm菌块3块，接入已装有50mL液体培养基的250mL锥形瓶中，于28℃，150r/min的条件下按照种子培养基优化设计方案进行6d振荡培养。

1.2.2 生物量测定[11]种子培养结束后，经两层纱布过滤，再经真空泵抽滤获得菌丝体，60℃恒温烘至恒重，电子天平称重，测得菌丝体生物量。

1.2.3 种子培养基优化

1.2.3.1 单因素实验 分别以不同浓度的碳源、氮源、无机盐代替基础培养基中的葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4，按照种子摇瓶培养条件进行6d振荡培养后，测定菌丝体生物量，考察单因素对种子生长的影响，并确定相应的浓度范围。

1.2.3.2 Box-Behnken设计 根据单因素实验结果确定最佳碳源、氮源、无机盐及其相应浓度范围后，以玉米粉（X1）、豆饼粉（X2）和MgSO4·7H2O（X3）三个因素为自变量，以菌丝体生物量（Y）为响应值，设计三因素三水平的Box-Behnken实验。实验设计因素及水平见表1。

表1 Box-Behnken设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 结果与讨论

2.1 不同营养条件对灵芝菌种子培养生物量的影响

2.1.1 碳源对生物量的影响 从图1可以看出，除茶饼粉外，其他碳源对UIM281菌丝体生长均有一定的促进作用，以多糖类碳源的促进作用最为明显。以玉米粉为碳源，当其浓度为25g/L时生物量最高，继续提高其浓度不会对菌丝体生长产生显著效果（图2）。玉米粉作为一种迟效碳源，在菌丝体生长过程中可被逐渐分解、利用，其蛋白质、维生素和矿物质等营养成分全面，可作为种子增殖培养的适宜碳源。茶饼粉中虽然含有35%～40%的多糖，但其内含的皂素、多酚等物质对微生物的生长不利，这可能抑制了菌丝体增殖，不适合作为UIM281碳源使用。

图1 不同碳源对生物量的影响Fig.1 Effect of different carbon sources on the biomass

图2 玉米粉浓度对生物量的影响Fig.2 Effect of corn flour concentration on the biomass

2.1.2 氮源对生物量的影响 从图3可以看出，UIM281对有机氮源的利用效果明显优于无机氮源，以豆饼粉效果最佳，蛋白胨、酵母膏次之。低浓度豆饼粉对菌丝体生长促进作用明显，当其浓度高于15g/L后，生物量基本保持恒定（图4）。同时观察到，培养基中过高浓度的豆饼粉可导致培养液粘稠，抑制了规则状菌球的形成，出现大团状结块，不利于溶氧。豆饼粉中的氨基酸种类和含量较丰富，且价格低廉，以其作为适宜的氮源，其浓度不宜超过20g/L。

图3 不同氮源对生物量的影响Fig.3 Effect of different nitrogen sources on the biomass

图4 豆饼粉浓度对生物量的影响Fig.4 Effect of soybean power concentration on the biomass

2.1.3 无机盐对生物量的影响 图5表明，与K+相比，Mg2+有利于UIM281菌丝体的生长，而Cu2+、Fe2+、Mn2+则抑制菌丝体增殖。Mg2+与生物量呈现一定程度的浓度依赖性，低浓度时对菌丝体生长有促进作用，高浓度则明显抑制菌丝体生长，当浓度为1.5g/L时，可获得最高生物量。所以，在后续实验设计中，选择Mg2+做优化实验。

图5 不同无机盐对生物量的影响Fig.5 Effect of different inorganic salt on the biomass

图6 镁离子浓度对生物量的影响Fig.6 Effect of Mg2+concentration on the biomass

2.2 响应面设计优化种子培养基

根据单因素实验结果，确定玉米粉、豆饼粉和MgSO4·7H2O作为影响U281生物量的关键因素，以生物量为指标，设计响应面实验，实验设计及结果见表2。

表2 响应面设计及结果Table 2 Design and results for RSM

运用SAS软件对实验结果进行回归拟和，获得生物量对培养基中的玉米粉、豆饼粉和MgSO4浓度的多元二次回归方程。

Y=24.84-1.54125X1-6.48125X2-1.0775X3-4.88375X12+4.3475X1X2-8.84875X22-0.385X2X3-5.47125X32-7.395X1X3

二次模型方差分析（表3）表明，回归模型Pr＞F=0.000564，失拟项Pr＞F=0.166038，表明模型回归极显著，失拟不显著；该模型的一次项、二次项对生物量的影响均达到极显著水平，交互项对生物量影响也显著。回归方程多元相关系数为0.9842，表明98.42%的实验数据的变异性可用此回归模型来解释，模型与实际情况拟合得很好，可以用此方程代替真实实验点进行分析和预测。通常情况下变化系数（CV）越低，实验的精确度和可信度越高，CV值等于12.82%，表明Box-Behnken实验的可信度和精确度较好；精密度是有效信号与噪声的比值，大于4.0视为合理，本实验精密度达到15.047。

表3 二阶回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance for quadratic regression eqution

二次模型中回归系数显著性检验（表4）表明，X2对生物量的线性效应极显著，而X1和X3不显著；X12、X22、X32对生物量的曲面效应均达到极显著；X1和X2，X1和X3对生物量的交互影响极显著。以上分析表明实验因素对响应值的影响不是单纯的线性关系，彼此存在交互作用。

表4 二阶回归方程系数显著性检验Table 4 Regression coefficients and their significances tests for quadratic eqution

2.3 菌丝体生物量的响应面分析

将X1、X2、X3三个参数分别固定，Y指标随其余的两个参数变化趋势分别如图7～图9所示。

图7Y=f（X1，X2）的响应面分析Fig.7RSM analysis for Y=f（X1，X2）

图7表明，在选定的实验水平范围内，生物量指标较高值落在X1、X2较低水平范围，表明豆饼粉与玉米粉浓度较低时可获得较高的生物量；继续提高二者浓度则不利于菌丝体生长，生物量均呈现逐步减少的趋势。在等高线图中，沿X2轴向等高线变化密集，而X1轴向等高线的变化相对稀疏，故豆饼粉对生物量峰值的影响大于玉米粉，是影响生物量的主要效应因子。

图8Y=f（X1，X3）的响应面分析Fig.8RSM analysis for Y=f（X1，X3）

图8显示了豆饼粉处于中心水平时，玉米粉与MgSO4·7H2O对生物量的交互影响。从等高线图可以看出X1、X3二因素间的交互作用较显著，因为等高线的形状反映交互效应的强弱大小，椭圆形等高线表示二因素交互作用显著[12]。生物量随MgSO4·7H2O与玉米粉浓度的增加都呈现逐步增加的趋势；到达最高极值点后生物量不再显著增加，这表明继续增大培养基中玉米粉和MgSO4·7H2O的浓度，不会对菌丝体的生长产生显著的促进效果。

图9Y=f（X2，X3）的响应面分析Fig.9RSM analysis for Y=f（X2，X3）

图9表明，随着豆饼粉浓度的增加，生物量呈现先增大后降低的趋势；而MgSO4·7H2O浓度的增加对生物量不构成显著影响，其对应的生物量只在小幅范围变化。从图中等高线与坐标轴的交点数可见，豆饼粉对生物量的影响远大于MgSO4·7H2O，是主要的影响因素。

由以上分析可知，豆饼粉对生物量有极显著影响，这与方差分析（表4）的结果一致。对回归方程中X1、X2和X3求一阶偏导并使其等于零，得到响应面稳定极值点对应的培养基参数：X1=-0.69815，X2=-0.54627，X3=0.39256，即玉米粉18g/L，豆饼粉12.3g/L，MgSO4·7H2O 1.8g/L，此时理论生物量达到26.94g/L。采用上述最优条件配制种子培养基，实际获得3组平行实验生物量的平均值为24.18g/L，与理论预测值相差不大，说明该模型对响应值的预测性很好。

3 结论

首先采用单因素实验确定了适合UIM281菌丝体生长的廉价适宜的碳源、氮源及无机盐，分别为玉米粉、豆饼粉和MgSO4·7H2O，并分别确定了各自的适宜浓度范围。在此基础上采用响应面法建立了以菌丝体生物量为响应值的全变量二次回归模型，在VB10.1g/L的条件下，得到了UIM281种子培养的优化条件：玉米粉18g/L，豆饼粉12.3g/L，MgSO4·7H2O 1.8g/L，在28℃，150r/min条件下振荡培养6d后，获得24.18g/L菌丝体，且菌丝体呈较规则球状，大小较均一，为下一步的产漆酶发酵提供优良的接种体奠定了良好基础。

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Optimization of the seed medium for laccase-producing strain Ganoderma lucidum by response surface methodology

ZHAO Shi-guang1，QIAN Sen-he1，ZHANG Yan1，CAI Wei-rong1，WANG Tao2
（1.Biochemical Engineering College of Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China；2.Food and Bio-engineering Department of Xuzhou Engineering College，Xuzhou 221008，China）

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）16-0232-05

2011－12－12

赵世光（1977-），男，博士，副教授，研究方向：微生物酶工程、农产品加工副产物高值化利用。

安徽省高校省级自然科学研究项目（KJ2011B025）；安徽工程大学引进人才科研启动基金（2007YQQ007）；安徽省科技厅国际科技合作计划项目（10080703035）。