乳酸菌发酵米糠产γ-氨基丁酸最适条件的研究

杨丽丽，赵城彬，吴 非

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

乳酸菌发酵米糠产γ-氨基丁酸最适条件的研究

杨丽丽，赵城彬，吴 非*

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

使用乳酸菌发酵米糠，以菌种、菌种添加量、发酵温度、发酵时间为单因素研究其对米糠发酵液中γ-氨基丁酸（GABA）含量的影响，在最适条件下，采用混料设计法，使用混合乳酸菌发酵米糠，以发酵液中GABA含量为指标，确定乳酸菌发酵米糠的最优条件为：在混合菌种嗜热链球菌S1添加量为1.55%，保加利亚乳杆菌L1添加量为1.45%，50℃下发酵米糠14h，发酵液中GABA含量最高，为287.975mg/100g。

米糠，乳酸菌，γ-氨基丁酸（GABA）

Abstract：Lactobacillus were used to ferment rice bran.Strains，adding amount of strains，fermentation temperature and fermentation time were used as single factorand their influence on the production of GABA of the fermented rice bran were researched.The mixture design method were used to determine the optimum conditions and mixed lactobacillus were used to fermente rice bran with the number of GABA content for index，lactobacillus ferments rice bran optimal conditions were investigated，the result showed：in the mixed bacteria streptococcus thermophilus cultured S1 add content was 1.55% ，Bulgaria lactobacillus L1 add content was 1.45% ，50℃fermented rice bran 14h，the number of GABA content was highest for 287.975mg/100g.

Key words：rice bran；Lactic acid bacteria；GABA

米糠是稻米碾白加工过程中碾下的皮层、米胚和碎米混合物，米糠中蛋白质含量较高，氨基酸组成丰富，营养全面。尤其是谷氨酸（Glu）的含量很高[1]。Glu为合成γ-氨基丁酸（GABA）的重要原料。GABA作为人体重要的神经递质，具有降血压、改善脑部血液循环、安神、健肾、利肝和改善脂质代谢等生理作用[2-7]。γ-氨基丁酸同其A型受体在胃癌SGC-7901细胞的表达及其对细胞增殖的影响、γ-氨基丁酸脂质体制备工艺的研究、富γ-氨基丁酸乳酸菌发酵功能饮料的研制是近些年营养界和医疗界共同关注和研究的一个热点课题。GABA天然存在量低，很难从一些天然动植物组织中大量提取分离。目前获得GABA的方法有化学合成法和生物法两大类，其中生物法包括植物富集法和微生物发酵法2种[8-9]。由于使用具有食品安全的微生物乳酸菌中的谷氨酸脱羧酶催化生产GABA，具有不受资源、环境和空间的限制等优点，而且乳酸菌是一种具有保健作用的益生菌，与食品工艺的关系密切，因此使用乳酸菌发酵米糠具有双重的经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米糠 东北农业大学实验室提供；副干酪乳杆菌1.0201、嗜热链球菌S1、保加利亚乳杆菌L1 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室提供；GABA标准品 美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯。

722可见光分光光度计 天津市泰斯特仪器有限公司；pHS-25型pH计 上海精科雷磁仪器厂；JD500-2型分析天平 沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；HH-4型电热恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；高速离心机 天津市泰斯特仪器有限公司；超净工作台 北京安泰科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌活化 从冷冻保存的3种菌株的冻存管中各取300μL菌液分别接入10mL MRS液体培养基中，40℃下活化培养24h，然后分别吸取1.5mL菌液于50mL MRS培养基中，40℃下培养18h，再分别吸取3mL菌液于100mL MRS培养基中，40℃下培养16h作为种子液。

1.2.2 GABA含量的测定 准确称量GABA 2500.000mg于500mL容量瓶中用蒸馏水溶解、定容为5.00mg/mL标准溶液，使用时准确配制0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mg/mL的GABA标准溶液系列。然后分别从配制好的0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mg/mL的GABA标准溶液中取出1.00mL，再依次加入0.01mol/L四硼酸钠缓冲液1.0mL，6%苯酚溶液1.0mL，7.5%次氯酸钠溶液1mL，混匀，沸水浴10min，立即冰浴5min，待溶液出现蓝绿色后，加入60%乙醇溶液2.0mL后于645nm下测定吸光值。以吸光值为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，并建立回归方程。样品发酵后，在12000r/min下离心15min，取发酵米糠上清液1.00mL进行比色法测定，测定方法同标准曲线的绘制时所用方法。

1.2.3 乳酸菌发酵米糠条件的优化 分别称取1g米糠于3只15mL发酵管中，分别加入10mL蒸馏水混匀，放入高压蒸汽灭菌锅中115℃灭菌15min，待试管温度降至30℃左右时，在无菌超净台中接入种子液进行发酵。

1.2.3.1 发酵温度对GABA产量的影响 在菌种添加量为2%的条件下，用副干酪乳杆菌1.0201发酵米糠，设定发酵温度分别为35、40、45、50、55℃，在此条件下发酵12h，比色法测发酵液中GABA含量，选取最佳发酵温度。

1.2.3.2 发酵时间对GABA产量的影响 在菌种添加量为2%、发酵液温度50℃的条件下，用副干酪乳杆菌1.0201发酵米糠，分别发酵10、12、14、16、18h，比色法测发酵液中GABA含量，选取最佳发酵时间。

1.2.3.3 菌种添加量对GABA产量的影响 以副干酪乳杆菌1.0201发酵米糠，在发酵液温度50℃，菌种的添加量分别1%、2%、3%、4%、5%的条件下发酵14h，比色法测发酵液中GABA含量，选取菌种最佳添加量。

1.2.3.4 乳酸菌类型对GABA产量的影响 在菌种添加量为3%，发酵温度50℃，发酵时间14h的条件下，分别使用副干酪乳杆菌1.0201、嗜热链球菌S1、保加利亚乳杆菌L1发酵米糠，比色法测发酵液中GABA含量，选取最佳发酵菌种。

1.2.3.5 混合乳酸菌对GABA产量的影响 在单因素实验的基础上以发酵温度50℃、发酵时间14h、混合菌种添加量3%为固定参数，采用混料设计实验[10-12]，使用混合乳酸菌发酵米糠，以A（副干酪乳杆菌添加量，%）、B（嗜热链球菌添加量，%）、C（保加利亚乳杆菌添加量，%）分别代表的因素为自变量，以GABA含量为因变量，来确定混合乳酸菌的配比的因素水平编码表，见表1。

1.2.3.6 验证实验 通过对混合菌不同配比发酵参数对考察指标影响的混料实验研究，得到了产GABA的优化值。在考察指标最优的混合菌发酵工艺条件下，进行5次验证实验取平均值，比对在最优混合菌发酵条件下各考察指标的验证值与预测值之间的标准偏差是否在合理范围内。

表1 因素水平编码表Table 1 Encode table of factors and levels

1.2.4 统计分析 单因素实验运用Excel进行数据绘图分析；混料设计使用Design Expert进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 副干酪乳杆菌1.0201发酵米糠产GABA的研究

实验标准曲线、发酵温度、时间、菌种添加量对副干酪乳杆菌1.0201发酵米糠发酵液中GABA含量的影响的测定结果分别见图1～图4。

图1 GABA标准曲线Fig.1 GABA standard curve

图2 温度对GABA含量的影响Fig.2 The influence of temperature on GABA content

图3 时间对GABA含量的影响Fig.3 The influence of time on GABA content

图4 菌种添加量对GABA含量的影响Fig.4 The influence of adding amount of strains on GABA content

图1经过数据分析，GABA标准曲线的回归方程为y=0.6993x-0.0418，相关系数R2=0.9982；图2发酵温度对GABA产量影响的结果为，50℃时发酵液中GABA含量最高，达248.55mg/100g；图3发酵时间对GABA产量影响的结果为，14h发酵液中GABA含量最高，达268.55mg/100g；图4菌种的添加量对GABA产量影响的结果，可以看出其添加量为3%时发酵液中GABA含量最高，达277.13mg/100g。

2.2 乳酸菌类型发酵米糠产GABA的研究

在菌种添加量为3%，发酵温度50℃，发酵时间14h的条件下，三种乳酸菌发酵米糠产GABA的研究结果见图5。

图5 乳酸菌类型对GABA产量的影响Fig.5 The influence on GABA production of Lactic acid bacteria types

由图5可以看出，三种乳酸菌发酵米糠中，保加利亚乳杆菌L1发酵液中GABA含量最高，达282.85mg/100g。

2.3 混合乳酸菌对GABA产量的影响

混料设计实验结果见表2。

表2 混料设计结果Table 2 Mixture design results

通过统计分析软件Design Expert进行数据分析，建立回归模型如下：

回归方程可信度分析见表3。其中，R2=0.9156，表明实验数据可用该模型进行解释，说明方程可靠性较高。CV值越低，显示实验稳定性越好。该实验的CV值为2.76%，较低，说明实验操作可信。

表3 回归方程可信度及方差分析结果Table 3 Creditability of regression equations

采用Design-Expert软件对模型方程进行方差分析，结果见表4。

表4 回归方程的方差分析结果Table 4 Regression equation of the results of variance analysis

由表4可知，线性混合对R值的影响显著（“Prob＞F”值＜0.05），表明方程因变量与自变量之间的线性关系明显。然而AC和BC对响应值影响也显著，说明实验因子对响应值不是简单的线性关系。该模型回归显著（“Prob＞F”值＜0.05），失拟项不显著（“Prob＞F”值＞0.05），说明该模型能很好地拟合各指标与混合菌比例。由F检验可以得到因子贡献率为：BC＞AC＞AB，即嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌混合作用发酵＞副干酪乳杆菌与保加利亚乳杆菌混合作用发酵＞副干酪乳杆菌与嗜热链球菌混合作用发酵。

混料设计优化结果与响应面分析图，见图6～图7。

图6 混料设计优化结果图Fig.6 Optimization results of mixing design

图7 响应面分析结果Fig.7 The response surface GABA

响应面可以直接反映出各因子对响应值的影响大小，通过优化结果可以直接看出最优条件下各因子的取值范围。由图7以及表4可知，副干酪乳杆菌与嗜热链球菌混合作用发酵对GABA含量的提高不明显，通过混料设计结果的优化和响应面分析可知，在本实验条件下，副干酪乳杆菌添加量X（A）、嗜热链球菌添加量X2（B）和保加利亚乳杆菌添加量X3（C）对应的编码值分别为0、0.516和0.484时，GABA含量有较大值在296.893mg/100g左右。与其对应的混合菌种最佳添加量为：嗜热链球菌添加量为1.55%，保加利亚乳杆菌添加量为1.45%。

2.4 验证实验

通过混合菌不同配比参数对各考察指标影响的混料实验研究，得到了乳酸菌发酵米糠产GABA的优化值。在混合乳酸菌的最优配比条件下，进行5次验证实验取平均值，结果为各考察指标的验证值287.975mg/100g与预测值296.893mg/100g之间的标准偏差均在合理范围内，说明响应值的验证实验值与回归方程预测值吻合良好。

3 结论

由单因素对GABA产量的影响的实验结果可知，在菌种添加量为3%、发酵温度50℃、发酵时间14h的条件下，保加利亚乳杆菌L1发酵液中GABA含量最高，达282.85mg/100g。而在同等条件下，利用混料设计后混合乳酸菌发酵米糠以嗜热链球菌S1添加量为1.55%，保加利亚乳杆菌L1添加量为1.45%时，最终发酵液中GABA含量达287.975mg/100g，高于任何单一菌液发酵米糠时发酵液中GABA的产量，即在混合菌同时使用时GABA的含量得到了进一步的富集，实现了高产的目的。

米糠价格低廉，发酵工艺简单，生产周期短，其发酵产物可进行后续处理，如GABA的提取或者富含GABA食品的开发等，预期会具有较好的市场前景。

[1]严聃.发酵法从米糠中提取高浓度γ-氨基丁酸粉末的工艺研究[J].湖南科技学院学报，2009，30（4）：89.

[2]V Satya Narayan，P M Nair.Metabolism enzymology and possible roles of 4-aminobutyric acid[J].Biochemistry，1989（8）：21-25.

[3]KiBum Park，SukHeung OH.Production of yogurt with enhanced levels of gamma-aminobutyric acid and valuable nutrients using lactic acid bacteria and germinated soybean extract[J].Bioresource Technology，2007，98：1675-1679.

[4]林智，大森正司.γ-氨基丁酸茶降血压机理的研究[J].茶叶科学，2001，21（2）：153-156.

[5]林智，大森正司.γ-氨基丁酸茶成分对大鼠血管紧张素Ⅰ转换酶（ACE）活性的影响[J].茶叶科学，2002，22（1）：43-46.

[6]HaiYuan，B Richard，Silverman.New substrates and inhibitors of γ-aminobutyric acid aminotransferase containing bioisosteres of the carboxylic acid group：Design，synthesis，and biological activity[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry，2006（14）：1331-1338.

[7]张晖，姚惠源，姜元荣.富含γ-氨基丁酸保健食品研究开发[J].食品与发酵工业，2003，29（9）：69-71.

[8]刘清，姚惠源，张晖.生产γ-氨基丁酸乳酸菌的选育及发酵条件优化[J].氨基酸和生物资源，2004，26（1）：21-25.

[9]NorikoKomatsuzak， Jun Shima， ShinichiKawamoto， et al.Production of γ-amionbutyric acid by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods[J].Food&Microbiology，2005（22）：497-504.

[10]张彩，童华荣，章道明，等.植物蛋白饮料配方优化研究[J].西南农业大学学报：自然科学版，2006，28（2）：197-200.

[11]童华荣，龚正礼.茶叶拼配的混料设计研究[J].茶叶科学，2004，24（3）：207-211.

[12]刘春光，周建斌，陈竹君.混料实验设计在肥料配比研究中的应用[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2001，29（1）：59-62.

Study on Lactobacillus fermentation in rice bran production gamma-aminobutyric optimal conditions

YANG Li-li，ZHAO Cheng-bin，WU Fei*
（Institute of Food，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

TS210.1

A

1002-0306（2012）16-0217-04

2011-12-01 *通讯联系人

杨丽丽（1985-），女，在读硕士研究生，研究方向：农产品加工与贮藏工程。

黑龙江省自然科学基金项目（C200942）。