玉米淀粉酶脱支处理过程的优化研究

高惠梅，赵 凯，刘丽艳，刘婧婷

（1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076；2.天津实发中科百奥工业生物技术有限公司，天津300462）

玉米淀粉酶脱支处理过程的优化研究

高惠梅1，2，赵 凯1，*，刘丽艳1，刘婧婷1

（1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076；2.天津实发中科百奥工业生物技术有限公司，天津300462）

为优化酶脱支水解过程，在单因素实验的基础上，采用响应曲面法对酶脱支水解的3个主要影响因素即：pH、温度、和酶添加量进行优化。建立了各因素与酶脱支水解产生还原力之间的数学模型。得出的最佳处理条件为：温度56℃、pH5.1、酶添加量28.92U/g。模型R2=0.9438，说明其拟合程度良好，可以用该模型优化酶脱支处理玉米淀粉的过程。

酶脱支，普鲁兰酶，响应曲面，玉米淀粉，优化

Abstract：The process of enzyme debranching corn starch was investigated.Based on the single factor experiment，the effect of pH，temperature and enzyme concentration on the yield of reducing value were optimized with Response Surface Methodology（RSM）.A mathematical model was established between the studied factors and the responses.The optimal conditions were as follows：temperature 56℃，pH5.1，and enzyme concentration 28.92U/g.The R2of 0.9438 means that the results were in good agreement with predicted values and the model was useful for optimizing the enzyme debranching process.

Key words：enzyme debranching；pullulanase；response surface methodology；corn starch；optimization

淀粉脱支酶能够专一性切开支链淀粉分支点的α-1，6糖苷键。根据脱支酶的作用方式，可将其分为直接脱支酶和间接脱支酶。前者可水解未经改性的支链淀粉或糖原中α-1，6糖苷键，而后者只能作用于已由其他酶改性的支链淀粉或糖原[1]。普鲁兰酶属于直接脱支酶，它在以淀粉为原料的食品加工中有着重要的作用。普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶协同作用可提高淀粉水解速率，减少葡萄糖淀粉酶的用量[2]。Slominska L等研究表明，降低底物浓度，提高酶添加量和反应时间，可以增加环状糊精的产量[3]。淀粉经过普鲁兰酶脱支处理后产生很多短直链淀粉，导致淀粉凝沉形成新晶体。新形成的晶体结构能延缓淀粉消化，从而形成缓慢消化淀粉。Soto R A G等研究表明每100g蜡质淀粉用10g普鲁兰酶水解4h后在1℃储藏，可获得较高得率的缓慢消化淀粉[4]。影响普鲁兰酶活力的因素有：温度、pH、离子强度、底物浓度、酶浓度、脱支时间等[5]。这些因素对普鲁兰酶脱支过程有重要影响。因此建立一个模型，把酶脱支程度和脱支过程的影响因素联系起来，对普鲁兰酶进一步开发应用有重要意义。响应曲面法是数学与统计学相结合的产物，它能以最经济的方式，以最少的实验数量和时间对实验进行全面研究。以回归方法作为函数估算的工具，将多因子实验中，因子与实验结果的相互关系，用多项式近似，把二者的关系函数化，依此可对函数进行分析，研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系，并进行优化[6]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米淀粉 黑龙江龙凤玉米开发有限公司；普鲁兰酶（酶活力400U/g）直链淀粉 Sigma-Aldrich Chemical Co.，Ltd.；冰醋酸、无水醋酸钠、3，5-二硝基水杨酸 均为国产分析纯。

BS224S电子分析天平 赛多利斯科学仪器北京有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；THZ-82A水浴恒温振荡器 江苏荣华仪器制造有限公司；80-2离心分离机 上海浦东物理光学仪器厂；SP-721E可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 还原力的测定 将玉米淀粉配成一定浓度的淀粉乳，在95℃水浴中糊化20min，调节淀粉糊的pH、温度、酶添加量，进行酶解实验。酶水解1h后，将酶解液在100℃水浴中灭酶20min，冷却离心，用3，5-二硝基水杨酸（DNS）测定上清液中还原糖的量。用上清液的还原力表示酶脱支水解程度[7]。

1.2.2 直链淀粉含量的测定 GB/T 15683-2008[8]。

1.2.3 pH对淀粉酶脱支程度的影响 根据预实验的结果，设定酶脱支反应的温度57.5℃，酶添加量20U/g，底物浓度2%，研究pH分别为3.5、4.0、4.9、5.5、6.5时，对酶脱支程度的影响。

1.2.4 温度对淀粉酶脱支程度的影响 根据预实验的结果，设定酶脱支反应的pH4.9，酶添加量20U/g，底物浓度2%，研究温度分别为40、45、50、57.5、65℃时，对酶脱支程度的影响。

1.2.5 酶添加量对淀粉酶脱支程度的影响 根据预实验的结果，设定酶脱支反应的pH4.9，温度为57.5℃，底物浓度2%，研究酶添加量分别为5、10、20、30、40、50、70U/g时，对酶脱支程度的影响。

1.2.6 底物浓度对淀粉酶脱支程度的影响 根据预实验的结果，设定酶脱支反应的pH4.9，温度为57.5℃，酶添加量为20U/g，研究底物浓度分别为1%、1.5%、2%、3%、4%时，对酶脱支程度的影响。

1.2.7 响应曲面的实验设计 通过前面研究表明温度、pH、酶添加量这三个因素对酶脱支过程有显著影响。采用中心组合实验设计对这三个因素进行优化，以脱支水解后上清液中还原力的变化为响应值，优化实验的水平及因素见表1。

表1 实验因素水平编码表Table 1 Coded values of the variables for the Box-Behnken design

1.2.8 数据处理 采用SPSS18.0软件进行数据处理、统计分析，采用Origin 8.0软件进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 酶脱支处理对还原力和直链淀粉含量的影响

图1 酶脱支处理对还原力和直链淀粉含量的影响Fig.1 The effect of enzyme debranching on the reducing value（RV）and amylose content

下图为淀粉乳浓度为2%，酶浓度为20U/g的条件下，脱支处理过程中还原力和直链淀粉含量的变化情况。从图1中可以看出，随着脱支时间的延长，酶浓度的增加，还原力、直链淀粉含量都呈上升趋势，而且二者趋势一致，所以在后续实验中，我们可以用还原力作为脱支程度的检测指标，考察不同酶脱支处理条件对脱支程度的影响。

2.2 pH对淀粉脱支程度的影响

pH改变普鲁兰酶活力中心上有关基团的电离状态，从而影响淀粉与酶的结合。酶的活力受环境pH的影响极为显著，通常在一定pH范围内才表现它的活性。由图2可见，pH在4～5.5区间，还原力较高；当pH＜3.5及pH＞6时，酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，使普鲁兰酶活性降低，从而还原力降低。可见4～5.5为酶脱支处理的最适pH范围。

图2 pH对还原力影响Fig.2 The effect of pH on the RV

2.3 温度对淀粉酶脱支程度的影响

图3可见，在40～50℃区间随着温度升高，还原力逐渐增加。反应速度随着温度升高而增加。但随着温度继续升高，尤其在超过57.5℃后，反应速度下降，还原力降低。温度升高，酶分子吸收过多能量，易引起其维持构象的次级键断裂，导致酶蛋白变性，反应速度随温度升高的效应将逐渐为酶蛋白变性效应抵消，反应速度迅速下降。所以酶脱支处理的适宜温度范围应为50～60℃。

图3 温度对还原力影响Fig.3 The effect of temperature on the RV

2.4 酶添加量对淀粉酶脱支程度的影响

由图4可见，随着酶添加量增加，还原力逐渐上升，酶添加量和还原力成线性关系，说明底物没有被酶饱和，此时的反应速度取决于酶添加量。随着酶添加量的增加，酶底复合物生成也增多，此时反应速度取决于酶底复合物的浓度，故反应速度随着酶添加量的增加而增高。但当酶添加量大于50U/g后，还原力增加缓慢，从经济角度考虑，选择低酶添加量（40U/g以下）。

2.5 底物浓度对淀粉酶脱支程度的影响

图4 酶添加量对还原力影响Fig.4 The effect of enzyme concentration on the RV

图5 底物浓度对还原力影响Fig.5 The effect of substrate concentration on the RV

由图5可见，随着底物浓度增加，还原力逐渐上升，底物浓度和还原力成线性关系。这主要是因为酶添加量较低，酶脱支时间较短，酶脱支水解的产物较少，产物竞争性抑制作用不明显，同时由于酶脱支水解产生的直链淀粉含量较少，直链淀粉之间没有产生凝沉现象。故还原力随着底物浓度的增加而增高。考虑到淀粉糊粘度随着底物浓度增加而增大，底物浓度高于4%会导致操作困难，故底物浓度应低于4%。

2.6 响应曲面的实验设计及结果分析

通过前面研究表明，温度、pH和酶添加量这三个因素对酶脱支过程有显著影响。采用响应曲面分析对这三个因素进行优化，以脱支水解后上清液中还原力的变化为响应值，用中心组合实验设计三因素五水平实验。优化实验的水平及因素见表1。设该模型通过最小二乘法拟合二次多项方程可表达为：

表2 实验安排及实验结果表Table 2 Box-Behnken Design matrix and experimental results

式中，Y为预测响应值，C0为常数项，C1、C2、C3分别为线性系数，C12、C13、C23为交互项系数，C4、C5、C6为二次项系数。为了确立二次多项方程式（1），利用Design Expert软件来进行实验设计和数据分析。实验设计方案和结果见表2。

利用Design Expert软件，通过表2中实验数据对方程式（1）进行多元回归拟合，获得上清液中的还原力对自变量pH、温度、酶添加量的二次多项回归方程式（2）：

对回归模型作显著检验和方差分析（见表3、表4）：p值越小，说明影响越显著[9]。模型F=18.65，p＜0.0001，说明模型回归效果是显著的，模型的校正系数Radj2=0.8932，说明有89.32%的变量可以用回归模型解释[10]。通过对回归方程各项方差分析得到一次项X1（温度）、X2（pH）、X3（酶添加量），二次项中的X1、X2对响应值影响显著，X2和X3交互作用对响应值影响显著。通过对预测值和真实值作图得到的各个点基本在一条直线上，说明模型拟合很好。失拟项p=0.2651＞0.05，失拟项不显著，说明真实值和预测值拟合结果较好。

利用软件对回归方程求解得到最佳脱支条件为：温度56.05℃、pH5.09、酶添加量28.92U/g，此条件下预测值为1.4128mg/mL。考虑到实际操作的方便，将最佳脱支条件改为：温度56℃、pH5.1、酶添加量28.92U/g。在此条件下的实际值为1.4146mg/mL，与预测值基本相符。

表3 二次多项模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for the quadratic mode

表4 回归方程各项方差分析Table 4 Significance of the coefficients of regression

通过前面分析，实验得到的二次方程能很好地预测在实验范围内不同单因素条件下的响应值。为了进一步确定方程的可靠性，在实验范围内，随机做三个验证实验来验证方程的可靠程度。实验安排见表5。

表5 验证实验Table 5 Confirmation experiment

验证实验的实际值和预测值的误差在0.2%～5%之间，残差的正态分布图在一条直线上，通过残差对预测值作图，残差分布无规律。通过以上的分析得出通过实验得到的回归方程的精确度很高[11-12]。

3 结论

将单因素实验和响应曲面结合对酶脱支水解玉米淀粉进行优化，获得的最佳工艺条件为：温度56℃、pH5.1、酶添加量28.92U/g。通过响应曲面的分析及验证实验表明，可以用响应曲面法优化酶脱支处理玉米淀粉的过程，同时可以通过响应曲面分析得出酶脱支水解的重要影响因素及预测酶脱支水解过程。

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Optimization of enzyme debranching process of corn starch

GAO Hui-mei1，2，ZHAO Kai1，*，LIU Li-yan1，LIU Jing-ting1
（1.Key Laboratory for Food Science and Engineering，College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；2.Tianjin SF-Bio Industrial Bio-tee Co.，Ltd.，Tianjin 300462，China）

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）16-0191-04

2011-12-06 *通讯联系人

高惠梅（1985-），女，硕士，研究方向：淀粉化学与工艺学。

黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划（1251G025）；黑龙江省高校科技创新团队建设计划（2010td04）。