超高效液相色谱-串联质谱测定红烧老抽中六种合成色素的方法

黄晓雯

（广东珠江桥生物科技股份有限公司，广东广州510075）

超高效液相色谱-串联质谱测定红烧老抽中六种合成色素的方法

黄晓雯

（广东珠江桥生物科技股份有限公司，广东广州510075）

建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC/MS/MS）同时测定红烧老抽中日落黄、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、诱惑红、亮蓝等6种合成色素的方法。样品用水稀释后经过聚酰胺粉柱子净化，采用超高效液相色谱-串联质谱进行分析。采用0.02mol/L乙酸铵和甲醇作为流动相，梯度洗脱，流速为0.2mL/min，在7min内实现6种合成色素的良好分离。串联质谱条件是正离子模式电离，采用多反应监测模式（MRM）。6种色素在10～1000μg/L的范围内线性良好。6种色素的方法最低检出限是10μg/kg，加标回收率在80.0%～93.4%之间，相对标准偏差在2.4%～6.8%之间（n=6）。本方法分析快速、定性准确、检出限低，应用到基质复杂的老抽类液体复合调味料的检测中效果较佳。

超高效液相色谱-串联质谱（UPLC/MS/MS），合成色素，红烧老抽，液体复合调味料

Abstract：A method of determination of six synthetic colorants including sunset yellow，lemon yellow，amaranth，carmine，allura red and brilliant blue in dark soy sauce by Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry was developed.The sample diluted by water was cleaned up with solid phase extraction polyamide column，analyzed by UPLC/MS/MS.The mobile phase was 0.02mol/L ammonium acetate and methanol in gradient condition.The flow rate was 0.2mL/min.Using the best gradient condition，six synthetic colorants achieved the grate separation in 7min.The condition of tandem mass spectrometer was positive ionization，using the Multiple Reaction Monitoring mode.And all the six synthetic colorants had a good linearity in a concentration range of 10～1000μg/L.The detect limit of the method was 10μg/kg to all six synthetic colorants.The spiked recoveries of six colorants ranged from 80.0%to 93.4%，with the RSDs of 2.4%～6.8%（n=6）.This method was rapid，showed good accuracy determination，and had a low limit of detection.It showed a satisfied effect of the testing in liquid multiple seasoning like dark soy sauce which had a complex matrix.

Key words：UPLC/MS/MS；synthetic colorants；dark soy sauce；liquid multiple seasoning

食用色素是食品添加剂的一种，是使食品染色后改善其色泽、提高其价值的呈色物质。食用色素分为天然色素和合成色素两种。合成色素由于成本低廉、色泽鲜艳、着色力强、着色稳定、可任意调配而应用广泛。然而，合成色素大多属于煤焦油合成的染料，长期食用对人体有害。合成色素大部分有慢性毒性或致癌性，故各国都严格控制其使用范围和使用量。根据GB2760-2011《食品添加剂使用标准》规定[1]，中国允许使用的合成食用色素共有8种：苋菜红、胭脂红、赤藓红、新红、柠檬黄、日落黄、靛蓝、亮蓝。液体复合调味料中的红烧老抽多用于烧菜上色，一些产品通过添加色素使菜肴色泽红亮以增加菜肴的吸引力。而酱油中是不允许添加合成色素的，液体复合调味料只允许添加柠檬黄[1]。目前，色素常用的检测方法有分光光度法[2]、薄层色谱法[3]、示波极谱法[4]、高效液相色谱法[5-12]。这些方法存在分析或计算过程较为复杂、样品前处理净化效果较差、定性定量不够准确的问题。目前针对酱油的合成色素检测方法的报道较少。相关的研究[5，11]也是采用直接稀释法进行简单的前处理，使用HPLC法进行检测。但由于老抽类液体调味料基质复杂，富含颜色深的焦糖色素，前处理采用直接稀释法会让样品中的杂质污染色谱质谱体系，影响方法的灵敏度。本文探讨红烧老抽类产品中合成色素的检测方法，优化聚酰胺粉吸附条件使基质复杂的调味液中合成色素能获得较好的净化效果；利用超高效液相色谱-串联质谱提高定性和定量的准确性，比HPLC的标准检测方法[6-7]获得更低的检出限，而且分析时间缩短了70%，分析效果满意。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

日落黄、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝标准溶液中国计量科学研究院，浓度0.5mg/mL；诱惑红标准品 德国Dr Ehrenstorfer GmbH；甲醇、甲酸 TEDIA公司；乙酸铵 Fluka公司，色谱纯；氨水 广州化学试剂厂，分析纯；实验用水 Millipore Q Plus处理的超纯水；聚酰胺粉 200目，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂。

ACQUITY UPLC Quatrro Premier XE超高效液相色谱-串联质谱仪 配有电喷雾离子源和Masslynx 4.1工作站，美国沃特世公司；pHS-3C酸度计 上海雷磁仪器厂；R210旋转蒸发仪 BUCHI；Bs210s天平北京赛多利斯仪器系统有限公司；砂芯玻璃层析柱20cm×2.5cm。

1.2 标准溶液配制

标准储备液：准确称取诱惑红12.5mg，用纯水定容至25mL，配成质量浓度为500μg/mL的单标溶液。准确吸取六种合成色素的500μg/mL溶液20μL（除诱惑红是固体标准品，其余色素均为标准溶液），用纯水定容到10mL，得浓度为10μg/mL一级中间液。用空白样品提取液稀释10μg/mL一级中间液得到1μg/mL二级中间液。

标准工作液：吸取适量二级中间液，用空白样品提取液定容得到所需的工作液及标准系列。

1.3 样品提取

称取1.00g红烧老抽样品到200mL烧杯，加20mL水稀释。用0.1mol/L HCl调至pH4，加入1g聚酰胺粉，搅拌均匀后于60℃水浴保温约20min以充分吸附色素。同时准备pH4的水与样品一起水浴60℃加热。然后趁热将悬浮液和聚酰胺粉转入玻璃层析柱中，用pH4、60℃热水少量分次洗涤至小烧杯，洗液倒入净化柱中，以2滴/s的速度进行层析分离。流出液弃掉。待样液流完后用pH4、60℃热水洗涤柱子至流出液无色，流出液弃掉。用甲醇-甲酸溶液（体积比6∶4）洗涤聚酰胺柱至流出液无色，再用超纯水洗涤柱子至流出液呈中性（大约4～5次，体积约150mL）。弃去全部流出液，并用洗耳球挤出柱子的水分。用氨水-甲醇溶液（体积比1∶9）40mL解吸色素，收集流出液至100mL梨形瓶中。减压蒸馏至色素解吸液近干，超纯水定容至10mL，经聚四氟乙烯0.22μm滤膜过滤后进高效液相色谱系统测定，外标法定量。

1.4 仪器条件

色谱条件：色谱柱：Acquity BEH C182.1mm×50mm，流动相：0.02mol/L乙酸铵溶液（A）和甲醇（B），流速：0.2mL/min，梯度洗脱设置如表1所示。

质谱条件：电喷雾电离，正离子模式，采用MRM多反应监测模式，毛细管电压：+3.00kV，锥孔电压：40V，二级锥孔电压：4V，离子源温度：100℃，脱溶剂气温度：300℃，脱溶剂气流速：700L/h，碰撞气Ar流速：0.15mL/min。MRM条件详细见表2。

表1 流动相梯度Table 1 Gradient table of the mobile phase

表2 6种色素质谱多反应监测离子条件Table 2 The MRM condition of six synthetic colorants

2 结果与分析

2.1 样品前处理优化

2.1.1 聚酰胺粉用量优化 本实验使用了1、2g聚酰胺粉来比较不同量的聚酰胺粉对红烧老抽中合成色素的吸附作用。同时，使用水配制的6种混合色素标准溶液做标准曲线对样品进行定量，使实验结果反映处理方法的原始基质影响情况。实验发现，经过1g聚酰胺粉处理的样品在串联质谱上的回收率比2g聚酰胺粉的回收率高（具体见表3）。同时实验使用HPLC法[12]对两种用量的处理方法的样品进行分析，发现两种聚酰胺粉用量处理的样品回收率基本无差别，表明使用1g聚酰胺粉做本方法的固相萃取柱填料已经足够吸附所测的合成色素。但在串联质谱上的回收率却表现出不同的现象。笔者认为这是不同用量的聚酰胺粉处理所得样品含的杂质不同导致的结果。由于本实验的对象是颜色深的红烧老抽，富含颜色较深的焦糖色素。焦糖色素对合成色素在质谱中的电离产生一定的基质效应影响。过多的聚酰胺粉反而会吸附过多的焦糖色素等杂质，增加了色素在质谱电离中受到的离子抑制作用，从而降低了合成色素的检测灵敏度。从表3中数据看出，使用1g聚酰胺粉处理的样液中各种合成色素的回收率要比使用2g的高，证明了使用1g聚酰胺粉处理的样品含的杂质比使用2g的少，对质谱电离的离子抑制作用也就小，检测的灵敏度就比较高。因此本实验采用1g聚酰胺粉来对色素进行吸附提纯。

表3 不同聚酰胺粉含量的处理方法的合成色素回收率比较Table 3 Comparison of recovery of six synthetic colorants by different amount of polyamide powder used in analysis

2.1.2 解吸液pH的调节 有研究[6-7]表示样品在解吸完毕后需要调节pH至中性再浓缩定容。本文利用将解吸液调节pH至中性和不进行pH调节直接减压浓缩定容上机的两种处理手段，并观察其色谱行为的差异，发现两者在峰形和保留时间上基本没有区别。笔者认为解吸液中的氨在减压蒸馏过程中已经被蒸馏出去，因此对样品pH影响很少。蒸馏后用水定容的样品pH为7.5左右，呈中性。因此本方法采取不进行pH调节直接减压浓缩定容上机分析的方式进行前处理，加快前处理的速度。

2.2 色谱条件的建立

本实验采用超高效液相色谱（UPLC）进行分析，使用1.7μm颗粒填料的BEH C18，能获得高柱效的色谱峰，而且大大缩短了分析时间和使用的溶剂体积，分析时间从一般的12～20min[5-10]缩短到7min，在批量检测的时候优势突出。

流动相优化：流动相的选择除了要考虑目标物、杂质的分离之外，还要考虑与质谱的匹配情况。由于UPLC/MS/MS要求尽量使用浓度较低的盐溶液作为流动相，以防止盐析堵塞管路与色谱柱，因此本方法实验了0.02、0.01、0.005mol/L的乙酸铵溶液与甲醇配比的体系进行分析。实验发现乙酸铵浓度至少要达到0.02mol/L才可以让合成色素在正离子电离模式下带电进入质谱检测器并获得良好的信号。通过设定梯度来实现对6种色素的完全分离并获得良好的高斯峰形。6种色素的总离子流色谱图见图1。

图1 6种合成色素的MRM总离子流色谱图和保留时间Fig.1 The MRM total ion chromatograms and retention time of six synthetic colorants

部分文献[7，10，13]表示乙酸铵溶液需要调节至酸性来进行分离，而另一部分文献[6，8，11]则表示pH呈中性才能获得良好的分离。笔者通过实验发现0.02mol/L乙酸铵溶液在不添加乙酸调节pH至酸性的时候获得的合成色素峰形是最佳的，此时溶液的pH为6.8左右。添加酸来调节pH偏酸性反而会抑制合成色素的电离。峰高随着pH的下降越变越小，部分色素在pH达到3.5的时候已经看不到有峰出现。合成色素以分子结构的形式存在，难以带电，无法电离成分子离子。因此0.02mol/L乙酸铵溶液在pH为接近中性的条件下才能使极性分子在色谱柱上获得良好峰形的同时使分子带电成为分子离子被质谱所监测到，酸性流动相会抑制分子的电离。

2.3 质谱条件的建立和定性确证

使用“T”形三通流路，通过蠕动泵不断地注入一定浓度的合成色素单体溶液。在正离子电离模式下，通过全扫描和子离子扫描优化毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂气温度与流量、碰撞气流量、碰撞室电压等参数至分析物达到最大灵敏度。通过全扫描找出各个合成色素对应的母离子，通过子离子扫描找出各母离子对应的子离子，灵敏度最高的子离子作为定量离子。

6种合成色素的分子离子均为[（M-nNa）+（n+1）H]型[13]，式中M是合成色素的分子，n是分子中钠离子的数量。如胭脂红的分子式为C20H11N2Na3O10S3，电离后分子中三个钠离子被三个氢离子取代，分子再加合一个氢离子带正电形成[（M-nNa）+（n+1）H]模式的分子离子。以此分子离子作为母离子进行二级质谱分析。其子离子扫描质谱图见图2。6种合成色素MRM色谱图和保留时间见图3。

本文的定性确证方法是利用目标物的两个离子对来进行定性。离子丰度最大的1个子离子作为定量离子，离子丰度次强的子离子作为定性离子。利用多反应监测模式进行检测。利用标准溶液和样品的定量离子与定性离子的相对丰度比值相比较同时结合保留时间来进行定性。

图2 6种合成色素的子离子扫描图Fig.2 Daughter scans spectrum of six synthetic colorants

2.4 标准曲线的配制、方法的线性范围与最低检出限

如2.1.1所述，由于红烧老抽样品基质复杂，净化后样品仍有少量基质效应影响质谱方法的灵敏度。为了校正基质效应带来的仪器灵敏度降低的影响，本方法采用空白老抽样品配制标准溶液的方法，使标准溶液与样品的基质背景基本一致，从而有效消除样品基质效应对定量准确性的影响。具体配制过程见1.2。在10～1000μg/L的浓度范围内，6种合成色素的峰面积与质量浓度（μg/L）呈良好的线性关系，6条曲线的相关系数r2均大于0.998。6种合成色素的线性方程见表4。

表4 6种合成色素的线性方程及相关系数Table 4 Linear equations for determination of the six synthetic colorants by this method

根据本方法的线性范围，10μg/L为仪器定量限浓度，对应本方法的定量限为100μg/kg。按信噪比S/N=3计算6种色素的仪器检出限均为1μg/L。按照本检测方法操作，最低检出限为10μg/kg。

2.5 精密度与回收率

平行称取6份1g空白老抽样品，并向样品添加一定量的合成色素标准溶液，按实验方法处理测定，使用外标法定量，并计算加标回收率（见表5）。6种合成色素精密度和加标回收率均满足多组分测定的定量要求。

表5 老抽中6种合成色素精密度与加标回收率（n=6）Table 5 Precision and recovery of six synthetic colorants in superior dark soy sauce（n=6）

3 结论

通过优化色素前处理过程提高红烧老抽的净化效率和优化超高效液相色谱分离条件来建立利用超高效液相色谱串联质谱（UPLC/MS/MS）对红烧老抽中6种合成色素进行测定的方法。方法灵敏度得到较大的提高，能获得更低的检出限。利用串联质谱定性更加准确，使用的分析时间比HPLC法缩短70%。用于分析测定老抽类液体复合调味料中的合成色素在定性和定量方面都得到了满意的结果。

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Determination of six synthetic colorants in dark soy sauce by UPLC/MS/MS

HUANG Xiao-wen
（Guangdong PRB Bio-Tech Co.，Ltd.，Guangzhou 510075，China）

TS207.3

A

1002-0306（2012）16-0092-05

2011-12-20

黄晓雯（1980-），女，本科，质量工程师，主要从事食品安全分析方面的研究。