反相液相色谱法测定膏状香精中邻苯二甲酸酯类

高兴海，陈湘来

（南京雨润食品有限公司深加工品管部检测中心，江苏南京210041）

反相液相色谱法测定膏状香精中邻苯二甲酸酯类

高兴海，陈湘来

（南京雨润食品有限公司深加工品管部检测中心，江苏南京210041）

采用反相液相色谱法研究了膏状香精中邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二正丁基酯（DBP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）4种邻苯二甲酸酯的萃取条件。利用正交实验对影响萃取总量的3个主要因素（正己烷用量、超声时间、水浴温度）进行了优化，确定了萃取的最佳条件：正己烷用量10mL，超声时间25min，水浴温度15℃。结果表明，该分析条件下，样品猪骨膏、牛肉膏的加标回收率为90%～94%。用乙腈-水等梯度洗脱（75∶25），4种PAEs分离较好，在0.5～20mg/L之间，色谱峰面积与4种邻苯二甲酸酯的浓度呈现良好的线性关系。

邻苯二甲酸酯，反相高效液相色谱，膏状香精

Abstract：Four phthalate acid esters in cream essence，such as dimethyl phthalate（DMP），diethyl phthalate（DEP），dibutyl phthalate（DBP） and benzyl butyl phthalate（BBP），were determined by reverse phase liquid chromatography.The conditions for extraction were researched.Orthogonal design experiment was carried out to optimize the 3 dominant factors（hexane volume，ultrasonic time，water temperature） affecting extraction recovery.The optimum conditions for solid phase extraction were determined as follows：hexane volume 10mL，ultrasonic time 25min，water temperature 15℃.Results showed that the recoveries of the four phthalates were 90%～94%.There was a good linear relationship between peak area and concentration of 4 phthalate esters in range of 0.5～20mg/L.

Key words：phthalate esters；reverse phase liquid chromatography；cream essence

邻苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）又称酞酸酯，是邻苯二甲酸酐与醇的反应产物，在塑料工业中常用作增塑剂和软化剂，用来增大塑料的可塑性和韧性[1-2]。该类化合物为无色透明的油状液体，无味或略带气味，难溶于水，易溶于有机溶剂，是一种具有生物毒性和发育毒性的环境雌激素，属持久性有机污染物，而且能通过食品生产过程、包装环节进入食物链，并在人体内富集，致使人体肢体畸形、内分泌失调、致癌以及生殖系统病变[3]。目前对水、牛奶、食用油中PAEs的检测方法以及含量的研究较多[4-5]，但有关食品添加剂中半固态膏状香精中增塑剂含量的分析研究很少有人报道。本文采用反相高效液相色谱分析方法，对半固体膏状香精中邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二正丁基酯（DBP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）进行定量分析，测定了食品添加剂膏状香精受PAEs污染的程度，为PAEs的安全性评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二正丁基酯（DBP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）（纯度大于99.5%） 德国Dr.Ehrenstoker公司，标准品；乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲苯 美国TEDIA公司，色谱纯；无水硫酸钠 上海久亿化学试剂有限公司，分析纯；超纯水 自制。

Waters2487高效液湘色谱仪（配有Waters 1525真空泵） 美国Waters公司；XTERRA RP18柱 美国Waters公司；超纯水发生器 美国Millipore公司；数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；氮吹仪 镇江仪器有限公司；固相萃取小柱（500mg/3mL）天津博纳艾杰尔科技有限公司；0.45μm针筒式微膜过滤器 上海摩速科学器材有限公司。

1.2 标准溶液的制备

准确称取DMP、DEP、DBP、BBP标准品各0.10g，分别用甲醇溶解定容至100mL，配制成1000mg/L的单标储备液于棕色容量瓶中。分别移取上述4种单标储备液各1mL，用乙腈定容至10mL，配制成100mg/L的混合标准储备液，置于4℃冰箱中保存备用。

1.3 膏状香精中PAEs的测定

1.3.1 膏状香精中PAEs的提取 准确称取0.5g膏状香精于试管中，加入一定体积（5～15mL）的正己烷在旋转混合器上混匀，再加入500mg无水硫酸钠，涡旋振荡3min，水浴加热，超声一定时间（15～25min），3000r/min离心10min，吸取上清液于具塞玻璃管中，在油相中加入一定体积正己烷重复上述步骤一次，合并的上清液作为待净化液体。

固相萃取方法：a.活化：5mL正己烷；b.上样：全部待净化液；c.淋洗：3mL正己烷；d.洗脱：3mL乙酸乙酯∶正己烷∶甲苯（50∶40∶10），洗脱2次，合并洗脱液。

40℃氮吹仪吹至近干，加入1mL乙腈反萃取，涡旋振荡3min，以4000r/min转速，离心5min，轻轻地将上清液倒入2mL样品瓶中，再用0.45μm滤膜过滤，高效相色谱法（HPLC）进行分析。

1.3.2 HPLC测定条件 色谱柱：XTERRA RP18柱（4.6mm×250mm，5μm）；检测器，波长226nm；柱温：30℃；进样量：10μL等梯度洗脱，流速1mL/min。

1.4 膏状香精中PAEs提取条件的确定

对影响PAEs萃取总量中的溶剂用量，水浴温度，超声时间三因素，分别选取三个水平，采用L9（34）进行正交实验设计，实验设计中的水平及编码表见表1。

表1 正交实验水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

2 结果与分析

2.1 定性分析

在HPLC同时检测多种PAEs时，首要问题是有效分离各种PAEs。因此，首先考察了不同浓度的乙腈对4种PAEs分离效果的影响。根据4种PAEs的极性，在控制流速1mL/min，柱温30℃不变的情况下通过调整洗脱液中乙腈和水的比例，使4种PAEs类物质基本分离。最终确定乙腈与水的比例为75∶25。从图1可见4种PAEs类物质分离效果较好，且保留时间都控制在10min以内。

图1 邻苯二甲酸酯标准品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of phthalate esters standard

2.2 定量分析

取100mg/L的邻苯二甲酸酯混合标准储备液，分别配制成0.5、1、2、5、10、20mg/L的系列标准溶液，进行HPLC分析，外标法定量，平行测定3次。以峰面积（Y）对质量浓度膏（X）进行线性回归，回归方程和相关系数见表2。由表2可知，4种PAE相关系数较高，满足实验要求。

表2 PAEs回归方程和相关系数Table 2 Regression equations and correlation coefficients of PAEs

2.3 膏状香精中PAEs提取条件的优化

根据表1正交实验水平表，进行实验，计算PAEs的平均回收率见表3。

使用SPSS 13.0软件对表3数据进行方差分析，得到表4～表7，由表4可知，在显著水平为0.05下，正己烷用量和超声时间对于PAEs的萃取总量有显著影响，且水浴温度对萃取总量影响不显著，所以各因素的主次顺序为：超声时间＞正己烷用量＞水浴温度。从表5可以看出A2均值最大，同理从表6、表7可以看出B1均值最大（正己烷容易挥发，温度较低，萃取液挥发较少），C3均值最大（超声时间过长，萃取效果越好），因此A2B1C3为最佳组合。

表3 正交实验结果Table 3 Results of orthogonal array design

表4 不同提取条件对萃取总量的方差分析Table 4 Analysis of variance for extraction amount with various extract conditions

表5 正己烷用量对萃取总量的影响Table 5 Influence of hexane volume on extraction amount

表6 水浴温度对萃取总量的影响Table 6 Influence of water temperature on extraction amount

表7 超声时间对萃取总量的影响Table 7 Influence of ultrasonic time on extraction amount

2.4 样品测定及方法回收率

分别称取不同膏状香精0.5g，采用最佳萃取条件：正己烷用量10mL，超声时间25min，水浴温度15℃，进行测定，并对样品进行加标实验，测定其回收率，并对每一种样品重复测定6次，进行分析方法的重复性实验。几种样品PAEs含量加标回收率测定结果见表8。

表8 不同膏状香精PAEs含量及加标回收率Table 8 Recovery rate and PAEs content of different cream essence

由表8可见，这两种样品PAEs加标回收率较为理想，其加标回收率在90%～94%之间。样品测定值相对标准偏差在1.1%～3.8%，说明本法重复性较好。另外，在猪骨膏和牛肉膏中均检出PAEs类物质，这表明样品在生产、加工、储运过程中可能被PAEs类增塑剂污染，也可能是由于食品包装容器塑料瓶中PAEs迁移出来的原因。

3 结论

3.1 以反相液相色谱法测定膏状香精中PAEs总量的最佳萃取条件：正己烷用量10mL，超声时间25min，水浴温度15℃。

3.2 最佳萃取条件下，猪骨膏、牛肉膏中的加标回收率为90%～94%。

3.3 用乙腈-水等梯度洗脱（75∶25），4种PAEs分离较好，在0.5～20mg/L之间，色谱峰面积与4种邻苯二甲酸酯的浓度呈现良好的线性关系。

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Determination of phthalate plasticizers in cream essence by reverse phase liquid chromatography

GAO Xing-hai，CHEN Xiang-lai
（Quality Control Department of Deep Processing，Nanjing Yurun Food Co.，Ltd.，Nanjing 210041，China）

TS207.3

A

1002-0306（2012）16-0076-03

2011-12-29

高兴海（1982-），男，硕士研究生，研究方向：食品营养化学。