HPLC-MS法测定食品中生物碱的研究

秦军燕，陈 文，夏寅强，瞿德敬，方国臻，王 硕

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457）

HPLC-MS法测定食品中生物碱的研究

秦军燕，陈 文，夏寅强，瞿德敬，方国臻，王 硕*

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，食品营养与安全教育部重点实验室，天津300457）

建立了一种高效液相色谱电喷雾质谱（HPLC-ESI-MS）法同时测定食品中六种生物碱的方法。采用ZORBAX SB-C8（2.1mm×150mm，3.5μm）色谱柱，乙腈（A）和pH5的4mmol/L乙酸铵溶液（B）为流动相，梯度洗脱使所有分析物均达到基线分离。采用ESI+一级质谱扫描模式得到甜菜碱、胆碱、苦参碱、阿托品、马钱子碱和乌头碱的定性离子，分别为m/z 118.2、104.2、249.5、290.3、395.4和646.4，结合质谱保留时间检测六种生物碱。结果表明，采用1.0mg/mL混合标准溶液，准确性好，RSD＜0.59%。该方法应用于检测实际样品荒漠肉苁蓉、山药、宁夏枸杞，添加回收率分别为81.7%～112.9%、80.8%～117.5%、96.9%～119.3%，说明建立的方法可以快速准确的检测实际样品中的生物碱成分。

高效液相色谱，电喷雾质谱，生物碱，实际样品

Abstract：An high-performance liquid chromatographic electrospray ionization mass spectrometry（HPLC-ESIMS） method was developed for the identification of 6 alkaloids in food.A mixture of acetonitrile（A） and pH5 4mmol/L ammonium acetate aqueous solution（B） were used as the mobile phase for the chro-matographic separation on ZORBAX SB-C8（2.1mm×150mm，3.5μm） column in the gradient elution mode.Under positive electrospray ionization mode，the protonated molecular[M+H]+ions for betaine（m/z 118.2），choline（m/z 104.2），matrine（m/z 249.5），atropine（m/z 290.3），brucine（m/z 395.4） and aconitine（m/z 646.4） and retain time were obtained as qualitative analysis.The experiment results indicated that RSD of the precision was less than 0.59%for adding 1.0mg/mL of spike standard.This method was used in the actual sample Herba Cistanche，Rhizoma Dioscoreae，Lycium bar-barum L testing and the average extraction recoveries were in the range of 81.7%～112.9%，80.8%～117.5%，96.9%～119.3%.A simple，rapid and accurate identification of 6 alkaloids was successfully achieved using the method.

Key words：liquid chromatography；electrospray ionization mass spectrometry；alkaloids；actual sample

肉苁蓉、枸杞和山药既是名贵的中药材，又是食疗同源的滋补产品，具有抗肿瘤、增强人体免疫力及维护心血管健康等功效。根据报道枸杞、肉苁蓉和山药均含有大量活性成分生物碱[1-4]，目前对该成分的检测方法有比色法[5]、高效液相色谱法[6-8]、液相质谱联用法[9-11]等。比色法测定过程复杂，而且需要乙醚等有机试剂，对人体危害较大。由于甜菜碱和胆碱结构中无共轭体系，高效液相色谱法仅能在低紫外吸收波长条件下测定，条件要求较高，灵敏度不够理想，或是衍生操作相对繁琐。目前虽然有采用高效液相质谱联用法测定生物碱成分的研究，但同时测定甜菜碱、胆碱、阿托品、苦参碱、马钱子碱及乌头碱六种生物碱的液相质谱方法还未见报道。本实验利用液相质谱法建立一种同时测定这六种生物碱的仪器检测方法，用于原料肉苁蓉、山药和枸杞中的生物碱成分测定，方便快速、简便，为其功效成分分析提供检测依据，对合理的利用和开发食疗同源的原材料具有很好的社会和经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜菜碱、胆碱、阿托品、苦参碱、马钱子碱、乌头碱标准品 Sigma公司，纯度均＞95%；乙腈、甲醇 美国Merck公司产品，色谱纯；甲酸、乙酸铵 天津市光复精细化工研究所产品，色谱纯；氨水 天津市风船化学试剂科技有限公司，分析纯；无水乙醇 天津市北联精细化学品开发有限公司产品，分析纯；水 经Millipore超纯水系统处理过的超纯水。

LCQ液相色谱-质谱联用仪：配有自动进样器、电喷雾离子源（ESI）、LCQ离子阱（ion trap）及Xcalibur1.4数据处理系统 美国Finnigan公司产品；ZORBAX SB-C8色谱柱（2.1mm×150mm，3.5μm） 美国Agilent；Centrifuge5804R台式冷冻离心机 德国Eppendorf公司产品；Millipore超纯水系统 美国Millipore公司产品；VGT-1730QT超声波清洗仪 美瑞泰克公司产品。

1.2 实验方法

分别称取0.5000g肉苁蓉粉末、山药粉和枸杞粉末，各加入10mL 20%乙醇水溶液，55℃超声辅助提取30min，在25℃下，4500r/min离心分离20min，重复提取2次，收集滤液，备用。取2.5mL提取液，置于250mL的容量瓶中，50%乙腈水溶液定容。取1mL上述溶液，经0.22μm的微孔有机滤膜过滤后进样。

1.3 测定条件

1.3.1 质谱条件 电喷雾（ESI）离子源；毛细管温度270℃；电喷雾电压4.5kV；鞘气流速9.0L/min；辅助气流速1.5L/min；扫描方式采用正离子模式下全扫描和SIM扫描方式；质量扫描范围：m/z 50～1000。

1.3.2 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C8色谱柱（2.1mm×150mm，3.5μm）；柱温：30℃；流动相：乙腈（A）和pH5 4mmol/L乙酸铵溶液（B）；梯度洗脱：0min，30%A；5min，70%A；10min，90%A；15min，50%A；30min，30%A；流速：0.2mL/min；进样量：10μL。

2 结果与讨论

2.1 优化质谱条件

采用1.0mg/mL六种生物碱的混合标准溶液优化质谱条件，注射泵手动进样。

2.1.1 确立毛细管温度 实验分别设置了不同的毛细管温度，在200～310℃范围内对混合标准溶液进行扫描测定，根据目标物的质谱响应强度选择最合适的毛细管温度，结果表明，随着温度的升高，目标物的响应值增强，当超过270℃时，由于温度过高，目标物损失增大，因此选择毛细管温度270℃。

2.1.2 确立毛细管电压 通过质谱扫描优化毛细管电压，根据目标物质谱响应强度的大小选择合适的毛细管电压，分别设置从0～60V的电压，通过全扫描模式检测混合标准溶液，在从0～30V过程中，随着电压的增大，目标物传输电离效果增强，仪器响应逐渐增大，但当再增大电压时，目标物传输损失增大，信号降低，所以选择30V为最佳电压。

2.1.3 确立电喷雾电压 分别设置2.0～5.5kV的电压，根据离子响应强度选择最合适的电喷雾电压值，在2.0～4.5kV过程中，喷雾电压的增大有利于目标物更好的充分发生电离，仪器信号逐渐增强，但过高的喷雾电压能够造成目标离子传输过程中的损失增大，所以选择4.5kV为最佳电压。

2.1.4 选定定性离子 根据以上优化条件，采用正离子扫描检测模式，ESI电离源条件下碱性化合物很容易加合质子，形成准分子离子峰[M+H]+和[2M+H]+，也会形成少量金属离子缀合物的[M+Na]+和[2M+Na]+形式，这些准分子离子峰的信息对应于生物碱化合物的分子量信息，为所测定样品是否是目标成分提供科学判据。在上述质谱条件下，甜菜碱、胆碱、苦参碱、阿托品、马钱子碱和乌头碱的质谱图见图1，分别选定m/z是118.2、104.2、249.5、290.3、395.4和646.4的准分子离子峰作为甜菜碱、胆碱、苦参碱、阿托品、马钱子碱和乌头碱的定性离子。

图1 甜菜碱（a）、胆碱（b）、苦参碱（c）、阿托品（d）、马钱子碱（e）和乌头碱（f）标准品在正离子模式下的质谱图Fig.1 Qualitative ion information of six alkaloids standard under positive ion mode

2.2 液相条件的确定

2.2.1 选择色谱柱 根据报道常采用C18和C8系列色谱柱，本实验选择Hypersil GOLD C18（2.1mm×100mm；Thermo）；ZORBAX SB-C8（2.1mm×150mm，3.5μm；Agilent）；ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6mm×150mm，5.0μm；Agilent）和ZORBAX Eclipse Pluse C18（2.1mm×150mm，3.5μm；Agilent）四种色谱柱；经过优化，采用色谱柱ZORBAX SB-C8（2.1mm×150mm，3.5μm；Agilent），可以达到基线分离且具有对称的峰形。

2.2.2 优化流动相梯度 采用梯度洗脱，通过不同梯度优化，在如下梯度洗脱时目标物得到较好的基线分离和峰型，因此选择梯度：0min，30%乙腈70%水相；5min，70%乙腈30%水相；10min，90%乙腈10%水相；15min，50%乙腈50%水相；30min，30%乙腈70%水相。

2.2.3 优化流动相盐溶液浓度 流动相中加入缓冲盐可以增加目标离子的电离效果，提高其仪器响应信号，根据仪器自身的条件，选择易挥发性的乙酸铵溶液作为流动相。分别配制浓度为0、2、4、5、6、8、10mmol/L的乙酸铵溶液，采用优化的质谱条件，结果如图2所示，在4mmol/L六种生物碱的仪器响应已经相对达到最大，考虑缓冲盐对质谱仪器的影响，最终选择乙酸铵浓度为4mmol/L。

图2 乙酸铵浓度对生物碱类物质峰面积的影响Fig.2 The effect on peak area of alkaloids about the ammonium acetate concentration

2.2.4 优化乙酸铵溶液的pH 流动相中通过添加酸调节pH可以提高电离效率，增加目标物的响应值，同时会影响各个物质的响应峰面积及保留时间，采用甲酸调节了一系列不同的乙酸铵溶液pH，分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，经过液相色谱质谱检测，如图3所示，当pH从3.0逐渐增大时，酸对生物碱类目标物的结构破坏降低，仪器检测响应逐渐增大，但在pH达到5.0之后，随着酸度降低，不利于加合质子，形成准分子离子峰，造成响应降低，所以，最终选择乙酸铵溶液的pH为5.0。

图3 流动相pH对生物碱类物质峰面积的影响Fig.3 The effect on peak area of alkaloids about the mobile phase pH

2.2.5 优化色谱柱柱温 在25～40℃范围内分别设置20、25、30、35、40℃五个温度水平，结果表明，柱温对生物碱成分的峰面积影响不大，考虑色谱柱使用寿命问题，选择柱温30℃。

按照优化好的液相色谱条件，得到六种生物碱的分离质谱图，1～6号峰依次分别为甜菜碱、胆碱、苦参碱、阿托品、马钱子碱和乌头碱，如图4所示。

图4 六种标准品高效液相质谱图Fig.4 The HPLC-MS of the six standard materials

2.3 精密度实验

精密吸取1.0mg/mL混合标准溶液，在上述液相质谱条件下重复进样6次，其六种生物碱标品的相对保留时间的相对标准偏差RSD小于0.59%，表明仪器精密度良好。

2.4 重现性实验

平行配制6份1.0mg/mL混合标准溶液，分别测定，结果六种生物碱标准品的相对保留时间的相对标准偏差RSD小于1.19%，表明方法重现性良好。

2.5 实际样品验证

实验测定了荒漠肉苁蓉、宁夏枸杞和山药三种实际样品，在荒漠肉苁蓉和宁夏枸杞的提取液中，图5（a）、（b）中1号峰的保留时间和质谱信息与甜菜碱标准品的信息匹配，定性为甜菜碱，其余峰为杂质峰，同时根据液相质谱信息证明，两者不含有胆碱、苦参碱、阿托品、马钱子碱和乌头碱。在山药提取液中，图5（c）中1号峰经过与标准品保留时间和质谱信息对照为胆碱，不含其他五种生物碱成分。

图5 （a）肉苁蓉样品、（b）宁夏枸杞样品、（c）山药样品的HPLC-MS图谱Fig.5 The HPLC-MS of alkloid components in sample Herba Cistanche（a），Lycium barbarum（b），Rhizoma Dioscoreae（c）

分别在三种实际样品中添加1.0mg/mL的混合标准溶液，按照1.2样品前处理方法，平行测定三次，添加回收率分别为81.7%～112.9%、80.8%～117.5%、96.9%～119.3%，RSD分别小于8.34%、10.03%、9.77%。

3 结论

建立一种快速准确的HPLC-ESI-MS法同时识别药食同源材料中生物碱成分，利用混合标准溶液优化质谱条件和色谱条件，方法精密度、重现性的RSD值分别小于0.59%、1.19%，将该方法用于实际样品检测，添加回收率分别为81.7%～112.9%、80.8%～117.5%、96.9%～119.3%，结果证明，建立的方法适合于实际样品中的生物碱成分识别。

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Study on determination of alkaloids in food by high performance liquid chromatography mass spectrometry

QIN Jun-yan，CHEN Wen，XIA Yin-qiang，QU De-jing，FANG Guo-zhen，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering&Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

TS207.3

A

1002-0306（2012）16-0073-04

2012-01-13 *通讯联系人

秦军燕（1986-），女，研究生，研究方向：食品安全检测。

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAK17B03）。