低氘水对皮肤成纤维细胞及黑色素瘤细胞的影响

张亚茹，吴 晟，姜银风，丛峰松*

1上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240;2上海家化联合股份有限公司，上海市 200082

低氘水的生物学效应已经有很多文献报道。最早Somlyai等［1］报道，低氘水可以抑制小鼠成纤维L929细胞的生长速率并且引起移植瘤小鼠肿瘤组织消退。俄罗斯研究人员最近［2-4］发现，如果把普通水中氘的体积分数减少65%，就会表现出一定的抗肿瘤特性，抑制瘤小鼠实验结果也显示，低氘水能抑制肿瘤生长，延长小鼠存活期。丛峰松［5］等报道，低氘水可以抑制肺癌移植瘤小鼠瘤体的生长。本文拟通过实验研究低氘水对正常皮肤成纤维细胞增殖、乳酸代谢以及对黑色素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑色素生成等方面的影响，并研究低氘水对紫外辐射后受损细胞的修复作用，初步探讨低氘水在化妆品方面的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

CCD-1095sk细胞和B16黑色素瘤细胞购自中科院细胞库。低氘水(DDW)由上海池天超轻水生物工程有限公司提供，氘含量分别为25，50和105 ppm;Hyclone血清购自赛莫飞世尔生物制品有限公司;MTT试剂盒购自南京凯基生物有限公司;LD检测试剂盒购自南京建成;MEM，RPM1640培养基粉剂购自GIBCO公司。酪氨酸酶(25KU)购自Worthington公司，L-Dopa购自SIGMA公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人正常皮肤细胞株CCD-1095sk培养在含10%进口胎牛血清的MEM培养基中，在37℃、5%CO2条件下培养。B16黑色素瘤细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO2条件下培养。

1.2.2 MTT 法测定 CCD-1095sk 细胞增殖

CCD-1095sk细胞(1×104个细胞/孔)接种于含100 μL培养液的96孔培养板中，对照组用正常MEM培养基培养，实验组分别用25、50和105 ppm的低氘水配制的MEM培养基培养，处理8、10、12、24和48 h后，加入50 μL MTT溶液继续培养4 h，吸净培养液后，每孔加 150 μL DMSO，振荡 10 min，在490 nm波长条件下，测定各孔的吸光度OD值。每组设5个复孔。

1.2.3 LD试剂盒测定CCD-1095sk细胞乳酸代谢

收集对数期CCD-1095sk细胞，悬浮，分别取等量细胞悬液至于用25，50和105 ppm的低氘水配置的MEM培养基中，在8、10、24和48h检测培养液中细胞代谢的乳酸含量。每组设三个平行对照。

乳酸(LD)含量=(测定管吸光度值-空白管吸光度值)÷(标准管吸光度值-空白光吸光度值)×标准浓度(3 mmol/l)×样本稀释倍数

1.2.4 体外酪氨酸酶活性测定［6，7］

根据酪氨酸活性测定参考文献，在3 ml反应体系中，含有 0.05 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.8)，以0.5 mmol/L L-DOPA作为测活底物，酪氨酸酶的终浓度为15.29 μg/mL。用分光光度计检测475 nm波长处的光密度值随着反应时间的变化，从直线部分的斜率换算出酶活力，消光系数ε为3700(mol/L·cm)-1。

1.2.5 细胞酪氨酸酶活性测定［8-10］

分别用 25、50和105 ppm的低氘水配置的1640培养基培养B16细胞，72 h后，弃上清。用pH 7.4的PBS洗涤细胞2次。每孔加10 ml/L的TrionX-100溶液90 μL，震荡5 min溶解细胞。经37℃温浴后，每空加1%L-Dopa 10 μL，继续孵育30 min，于490 nm波长处检测吸光度。每组设五个复孔。

酪氨酸酶活性抑制率=(1-各浓度平均吸光度值÷对照组平均吸光度值)×100%

1.2.6 黑色素含量测定［10，11］

采用改良的Hideya Ando方法，用不同浓度的低氘水培养B16细胞72 h后，调整细胞浓度至105个/mL。吸取细胞悬液分别置于离心管中，离心弃上清。用200 μL PBS缓冲液重悬细胞沉淀后，加入1 mL 1∶1乙醇乙醚液，在室温下放置30 min。3000 rpm离心5 min后弃上清。加入1 mL含10%DMSO的 1mol/L NaOH溶液，80℃水浴45 min后于470 nm波长处测定吸光度值。每组设三个平行对照。

黑色素合成抑制率=［1-(药物孔吸光度值÷药物孔细胞密度)÷(对照孔吸光值÷对照孔细胞密度)］×100%

1.2.7 紫外损伤实验

收集对数期CCD-1095sk细胞，调整细胞浓度为105个/mL。1(104个细胞/孔接种于含100 μL培养液的96孔培养板中，分别用25、50和105 ppm的低氘水配置的MEM培养基及正常MEM培养基培养4 h后，进行紫外照射。照射条件:UVC灯管功率15 W，波长254 nm，垂直照射距离20 cm，照射时间2 h。然后继续培养8 h，用MTT检测细胞的生长增殖情况。以不照射的细胞作为阳性对照组。每组设6个复孔。

1.2.8 统计学方法

数据均以means±SD表示，采用SPSS 11.0统计软件包进行数据分析，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 低氘水对正常皮肤成纤维细胞CCD-1095sk的影响

用不同浓度的低氘水培养CCD-1095sk细胞，在培养的初期，低氘水表现为促进细胞生长。在8 h时，25 ppm和50 ppm的低氘水作用的细胞增殖率分别为102.27%和104.09%，与对照组相比较，差异具有统计学意义，P＜0.05，如图1A，1B所示。在10 h时，25 ppm的低氘水作用的细胞增殖率为104.75%，与对照组相比较，差异具有统计学，P＜0.05。当培养至12 h以后，用低氘水培养的细胞逐渐开始出现生长抑制现象。当继续培养至48 h时，低氘水又开始促进细胞生长。其中，105 ppm的低氘水作用最为明显，增殖率为103.66%，与对照组相比较，差异具有统计学意义，P＜0.05，如图1C所示。

图1 不同浓度的低氘水对正常皮肤成纤维CCD-1095sk细胞增殖的影响Fig.1 Effects of DDW on the proliferation of CCD-1095sk cells.A:25 ppm DDW;B:50 ppm DDW;C:105 ppm DDW.*:P ＜0.05，vs control

2.2 低氘水对细胞CCD-1095sk细胞乳酸生成的影响

用不用浓度的低氘水培养CCD-1095sk细胞，取上清培养液检测细胞代谢的乳酸(LD)的含量。结果显示，培养至10 h时，用50 ppm和105 ppm的低氘水培养的细胞液中乳酸产量明显低于正常对照组，乳酸产率分别为正常组的68.47%和85.87%，差异具有统计学意义，P＜0.05。培养至48 h时，用25 ppm和50 ppm的低氘水作用的CCD-1095sk细胞液中，乳酸产率分别为正常组的 81.22%和82.64%，差异具有统计学意义，P＜0.05，如图2所示。实际乳酸的含量见表1。

图2 不同浓度的低氘水对CCD-1095sk细胞LD生成的影响Fig.2 DDW affects contents of LD of CCD-1095sk cells.

表1 CCD-1095sk细胞LD含量(mmol/L)Table 1 LD content of CCD-1095sk cell(mmol/L)

2.3 DDW对酪氨酸酶活性的影响

在体外生化反应体系中，25 ppm与105 ppm的低氘水对酪氨酸酶活力抑制率为3.67%，50 ppm的低氘水对酪氨酸酶活力抑制率为11.89%，如Fig 3所示。

图3 不同浓度的低氘水对酪氨酸酶活性的影响Fig.3 Effects of DDW on tyrosinase activity.

2.4 DDW对B16细胞酪氨酸酶活性的影响

用不同浓度的低氘水作用B16黑色素瘤细胞72 h后，以L-DOPA作为测活底物，检测细胞中酪氨酸酶的活性。50 ppm和105 ppm的低氘水对酪氨酸酶的抑制率分别达到44.32%和24.51%，差异具有统计学意义，P ＜0.05，Fig 4。

图4 不同浓度的低氘水对B16细胞酪氨酸酶活性的影响Fig.4 Effects of DDW on tyrosinase activity in B16 cells.

2.5 低氘水对B16细胞黑色素生成的影响

用不同浓度的低氘水作用B16黑色素瘤细胞72 h后，50 ppm的低氘水对B16细胞的黑色素生成的抑制率为39.59%，25 ppm和105 ppm低氘水对B16细胞的黑色素生成的抑制率分别为26.45%和24.61%，与对照组相比较，差异具有统计学意义，P＜0.05，如 Fig 5 所示。

图5 不同浓度的低氘水对B16细胞黑色素生成的影响Fig.5 Effects of DDW on melanogenesis.

2.6 低氘水对受到紫外损伤细胞的修复作用

与阳性对照组相比较，经紫外照射的细胞受到损伤，细胞增殖降低了30.43%，差异具有统计学差异(P＜0.01)，说明紫外损伤的模型是成功的(阳性对照组细胞不经过紫外照射)。用不同浓度的低氘水作用经紫外照射的CCD-1095sk细胞，结果显示，用50 ppm的低氘水培养的细胞增殖率为105.37%，与对照组相比较，差异具有统计学意义，P ＜0.05，如图6所示。

图6 低氘水对紫外损伤细胞增殖的影响Fig.6 Effects of DDW on cell proliferation after irradiation of UVC

3 结论

现代科学技术的飞速发展和广泛应用给化妆品行业带来全新的发展机遇，化妆品已从洁肤，润肤为目的的基础护肤品向延缓衰老，美化肤色为目的的功效性化妆品方向发展［12］。人们对化妆品的关注已经不再是单纯的美丽动人，而是转向其安全性。普通水中，氘和氕的比率(D/H)大约是1∶6600，即水中氘的体积分数为0.015%［13］。我们把氘体积分数低于0.015%的水称为低氘水(deuterium-depleted water，DDW)。氘和氕由于质量不同导致氢的这两种稳定同位素之间物理和化学性质的不同［14，15］。

皮肤的弹性、光滑等外观一定程度上由构成皮肤不同组分的细胞的增殖和分裂所决定［16］。本次实验结果表明，在细胞培养的初期，不同浓度的低氘水均表现出促进细胞增殖活力，同时细胞中乳酸的产量减少。

皮肤色调的主要因素是皮肤内的黑色素，肤色的深浅主要决定于黑色素细胞合成黑色素的能力［16］。酪氨酸酶 (tyrosinase)俗称多酚氧化酶，普遍存在于人和动植物体内，是黑色素生物合成过程中必不可少的关键酶。它能将L-多巴氧化成多巴醌，多巴醌不稳定，可以经一系列的非酶促反应后，形成由5，6-二羟吲哚和 5，6-二羟吲哚-2-羧酸单元构成的异聚体-黑色素［17］。如果该酶活力过高，可形成黑色素瘤，因此引起了人们对酪氨酸酶的关注。体外生化实验表明，三种不同浓度的低氘水能不同程度地抑制酪氨酸酶活性。细胞实验证实，50 ppm和105 ppm的低氘水能显著抑制B16细胞的酪氨酸酶活性，降低细胞黑色素生成量，差异具有统计学意义，P ＜0.05。

随着臭氧层破坏的加重，到达地球表面的紫外线日益增多。紫外线辐射(UVR)会导致皮肤细胞的活性氧(ROS)增加，引起DNA和角膜损伤，促进皮肤光老化和癌变以及白内障、免疫抑制等疾病的发生［18-20］。Bild 等［21］人用 30 ppm 的低氘水喂养小鼠15天，然后用8.5 Gray的半致死量射线进行照射。对照组小鼠用普通水喂养，用同样剂量的射线照射。结果显示，实验组的小鼠存活率为61%，而对照组小鼠的存活率仅有25%。我们实验也证实:50 ppm的低氘水能促进受到紫外损伤的CCD-1095sk成纤维细胞的增殖生长，与正常对照组比较，差异具有统计学意义，P＜0.05。以上结果提示，低氘水对细胞DNA损伤具有一定修复作用，但其具体的分子机制尚需进一步研究。

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