石榴皮抗氧化活性成分的提取及其组分的研究

纪白慧，倪鑫炯，曹玉华

江南大学化学与材料工程学院，无锡 214122

(石榴(Punica granatum L.)，又名安石榴、干石榴、若榴、丹若、天浆等，为石榴科石榴属植物，原产于伊朗、阿富汗等中亚地区。石榴在我国历史古老渊远，自西汉张骞出使西域引入我国至今已有两千多年。经过长年来不断培育和优选，在我国已经形成了较有影响力的五大种植地区:陕西临潼，山东枣庄，安徽怀远，四川会理，云南蒙自。据不完全资料统计，我国石榴的栽植总面积已经达到100万亩，超过了伊朗的石榴面积，跃居世界第一位。石榴果树形态优美，果实风味可口，营养丰富，不仅可以生食，还可以加工制成石榴果汁、果酱、果酒等，是集生态、经济、观赏和保健多重功能的优良果树。

石榴皮含有丰富的多酚类物质，包括鞣花单宁、没食子单宁、鞣花酸、没食子酸等，占干重量的10%～20%，是石榴皮的重要组成成分。中国药典规定干燥石榴皮中所含鞣质不得低于10.0%［1］。此外石榴皮中还含有天竺葵素、飞燕草素类花色素以及有机酸等成分［2］。作为一味古老的民间医药，石榴具有多种药理作用，石榴皮酸、涩、温，有涩肠止泻，止血，驱虫之功效，可用于久泻、久痢、虫积腹痛等疾病的治疗［1］。现代药理研究表明，石榴皮提取物能够有效的降低罹患一系列疾病的风险，如某些类型的癌症、炎症、心血管疾病及神经退化等病症［3-6］。此外，石榴提取物还被研究用于食品防腐和化妆品领域［7-10］。因此，研究和鉴定石榴皮潜在的对人类健康有益的活性物质以提高其生物利用度有着重大意义。近年来，抗氧化成为研究者密切关注的热点，许多科学工作者致力于从植物中提取更为安全的天然抗氧化剂来取代人工合成的抗氧化剂［11，12］。国内外已有报道指出石榴皮提取物对O-·2、·OH自由基、抑制 LDL 等方面有显著的抗氧化活性［13，14］，但并未对石榴皮中确切的抗氧化活性成分分析进行深入研究。目前，对于石榴皮活性成分的提取主要采用浸提法、回流提取法、超声波提取法、微波提取法等，其中超声法和微波法作为新型的提取方法方便、快速、高效而较受青睐［15-17］。本实验以DPPH抑制率为指标超声提取石榴皮抗氧化成分，经溶剂萃取及大孔吸附树脂纯化后利用液相色谱-质谱联用法(LC-MS)鉴定其主要成分，以期得到新型天然抗氧化剂，为石榴的开发研究提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

石榴:产地云南蒙自，江苏无锡市大润发超市售;DPPH(sigma公司);无水乙醇、浓盐酸、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇(均为国药集团化学试剂有限公司)，分析纯;甲酸、甲醇、乙腈(国药集团化学试剂有限公司)，色谱纯;大孔吸附树脂(天津海光科技有限公司)。

1.2 仪器

JA2003电子分析天平(上海分析天平仪器厂);TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);RE-52C旋转蒸发器、循环水式多用真空泵(河南省巩义市站街光亚仪器厂);Wasters ACQUITY UPLC液-质联用仪(美国Wasters公司)。

2 实验方法

2.1 石榴皮抗氧化成分提取的正交实验

2.1.1 石榴皮的提取

将石榴皮冷水洗净，置于40℃恒温鼓风干燥箱中烘干，粉碎机粉碎。准确称取5.0 g石榴皮粉末超声提取3次，合并滤液并旋转蒸发去除溶剂得红棕色膏状物，配成生药浓度为0.1mg/mL的石榴皮粗提液，测定其DPPH抑制率。

2.1.2 抗氧化性的测定

准确称取DPPH标准品20 mg，以无水乙醇定容于250 mL容量瓶中，得浓度为0.08 mg/mL的DPPH溶液。精密吸取DPPH溶液3 mL，加入不同提取方法得到的石榴皮提取液1 mL，摇匀后室温静置30 min，用紫外分光光度计在517 nm处测定吸光度值A1，同时测定3 mL无水乙醇与1 mL样品溶液在517 nm处的吸光度值A2，空白组以1 mL无水乙醇代替试样，按下式计算清除率:

A1:加DPPH后样品溶液吸光度值;A2:不加DPPH，样品溶液本底吸光度值;A0:不加样品，空白吸光度值

2.1.3 正交试验设计

选取乙醇浓度、pH、料液比、提取时间四个因素进行考察，设计正交实验表L9(34)如表1，以DPPH抑制率作为评价标准，确定石榴皮抗氧化成分最佳提取工艺。

表1 正交实验因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

2.2 萃取分离

在最佳提取条件下提取石榴皮抗氧化成分，旋转蒸发以除去溶剂得浓缩物。浓缩物用热水温浸，冷却至室温后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水多次萃取。各极性部分除去溶剂后，将得到的5个萃取部分浓缩，以萃取溶剂定容于50 mL容量瓶，取0.1 mL各萃取液用无水乙醇稀释成50 mL，采用2.1.2下所述方法测定对 DPPH的抑制率。

2.3 大孔吸附树脂纯化

2.3.1 大孔吸附树脂的选择

称取经过预处理的D101、AB-8、NKA-9三种大孔吸附树脂各2 g于150 mL锥形瓶中，加入已知浓度为0.8 mg/mL石榴皮萃取液50 mL(DPPH的抑制率AC1)，吸附过夜，待充分吸附后，过滤，测定滤液中的DPPH的抑制率AC2。静态吸附一定时间后，过滤除去石榴皮粗提物溶液，树脂用蒸馏水洗净，置于100 mL锥形瓶中，加入50 mL无水乙醇，于相同条件下解吸，取一定量解吸液，测定其DPPH的抑制率AC3，并按下面的公式计算吸附率、解吸率及回收率。

式中AC1为起始溶液的DPPH抑制率，AC2为剩余溶液的DPPH抑制率，AC3为解吸液的DPPH抑制率

2.3.2 D101 大孔吸附柱纯化

为了分离得到纯化物，将浓缩后的正丁醇萃取物加入预处理过的D101大孔吸附树脂中，待活性成分与树脂充分交换后，先用1 BV的蒸馏水冲洗去除提取物中的糖类、蛋白质等大分子，控制流速为2 BV/h。水洗脱后再用3 BV的60%乙醇溶液进行解吸，收集解吸液。解吸液经旋转蒸发浓缩得石榴皮纯化物。

2.4 液相色谱-质谱联用法(LC-MS)分析

取一定量石榴皮纯化物的甲醇溶液进行液相色谱-质谱联用分析。色谱条件:BEH C18色谱柱 (2.1 mm ×100 mm × 1.7 μm);WATERS ACQUITY PDA检测器;检测波长380 nm;流动相为乙腈(A相)-0.1%乙酸水溶液(B相)，梯度洗脱程序:0～0.1 min，100%B 相，0.1～5 min，0～30%A 相，100%～70%B 相，5～7 min，30% ～100%A 相，70% ～0%B 相;柱温:45 ℃;流速:0.3 mL/min，进样量:1 uL。质谱条件:离子条件ESI-，毛细管电压3.5 kv;锥孔电压20 v;离子源温度100℃;脱溶剂温度300℃;质量范围50～1000，检测器电压:1700 v。

3 结果与分析

3.1 正交实验分析

通过正交实验对影响提取的四个因素进行极差分析，以DPPH抑制率为应力进行评价，结果见下表，各因素对石榴皮抗氧化成分提取的影响程度为料液比＞提取时间＞乙醇浓度＞pH，最佳提取组合为A2B1C2D2，即最佳提取工艺为:乙醇浓度60%、pH3、料液比(m/v)1∶15、提取3 次，每次40 min。

表2 正交实验结果Table 2 The result of orthogonal design test

3.2 石榴皮各萃取物抗氧化性

利用不同极性溶剂萃取，分别得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇及水五种萃取物。其中，石油醚和氯仿萃取物均为淡黄色粉末，乙酸乙酯萃取物为淡黄色晶状物，正丁醇萃取物为棕黄色粉末，水萃取物为深棕色膏状物。各部分萃取物抗氧化效果如下图所示。

图1 石榴皮各萃取物DPPH抑制率Fig.1 DPPH scavenging of different extractives

从图1可以看出，各部分萃取物对DPPH抑制作用强弱顺序为:正丁醇萃取物＞水萃取物＞乙酸乙酯萃取物＞氯仿萃取物＞石油醚萃取物。石油醚和氯仿萃取物因为其主要成分为脂溶性和弱极性物质，故抗氧化效果较弱，DPPH抑制率仅为4.13%、5.62%。乙酸乙酯萃取物的 DPPH抑制率为21.95%，显示出一定的抗氧化效果，但抑制作用不够明显。水萃取物的颜色最深，且抑制率达到41.15%，可能一些色素类成分溶于其中而具有较强的抗氧化作用。正丁醇萃取物的抑制率最高，达62.68%，表明该萃取部分含有丰富的抗氧化活性物质，故对该部分萃取物进行深入研究。

3.3 大孔吸附树脂的选择

表3 三种树脂物理性能及吸附性比较Table 3 physical properties and adsorbabilities of three resins

评价一种树脂的优劣主要考察其吸附性能以及解吸性能这两个重要参数。三种大孔吸附树脂吸附性能筛选结果见表3。由表3可以看出，三种树脂对石榴皮抗氧化成分均有吸附作用。其中，D101树脂无论是吸附率，还是解吸率都要优于其他两种树脂，且回收率也达到76.18%。虽然D101为非极性树脂，但是能够特异性吸附水溶性多酚类物质，这可能与其适合的表面结构、较高的比表面积及较小的孔径有关。综合考虑，选择D101树脂纯化石榴皮中的抗氧化成分。

3.4 石榴皮萃取物液相色谱图分析

经纯化处理过的石榴皮萃取液经液相色谱法分析后得到液相色谱图，由图可以看出石榴皮萃取物主要含有两个色谱峰，分别在保留时间t1=1.39 min和t2=1.68 min。为了确定这两个组分，采用质谱法进行了分析。

图2 石榴皮纯化物液相色谱图Fig.2 UPLC chromatograms of pomegranate peel purificated fraction

3.5 石榴皮纯化物质谱图分析

通过质谱对石榴皮抗氧化组分进行定性分析得到的结果如下图(图3、图4)，根据质谱所得的碎片峰、准分子离子峰、特征离子的质谱分布及液相色谱的保留时间，参考相关文献［18-21］，确定了这两个组分分别是 α-安石榴苷(t=1.39 min)和 β-安石榴苷(t=1.68 min)两种异构体，属于石榴皮中结构较复杂的鞣花单宁类物质。

图3、图4显示这两种物质对应的分子离子峰［M－H+］均为m/z1083。主要形成四种碎片离子m/z=781、m/z=601、m/z=301 及 m/z=275。推断其裂解途径(图5)为安石榴甙(punicalagin，m/z=1083)失去一分子六羟基联苯二甲酰基(HHDP)，形成安石榴林(punicalin，m/z=781)，安石榴林失去一分子的葡萄糖得到没食子酸四聚体(gallagic acid，m/z=601)，再裂解形成鞣花酸(ellagic acid，m/z=301)，鞣花酸开环脱去一分子甲酰基(-CO)最后形成 3，4，8，9，10-五羟基-［b，d］-苯并吡喃-6-酮(m/z=275)。一般来说，鞣质中的酚羟基是其具有生理活性的基础，可水解鞣质的酚羟基数目越多其生理活性越强，同时，连接位置、立体构型及结构中其他基团都是与活性强弱有关的重要因素［22］。从结构上看，安石榴苷含有HHDP及多个酚羟基结构，由多个的酚核串联而成，这些活性基团决定了安石榴苷对DPPH显示出很强的抑制作用。

图5 石榴苷异构体UPLC-MS裂解途径Fig.5 UPLC-MS fragmentation of punicalagin isomers

4 结论

通过正交实验分别考察了提取溶剂的浓度、pH、料液比、提取时间四个因素对石榴皮抗氧化成分提取的影响，得到最优化提取条件为:乙醇浓度60%、pH=3、料液比(m/v)1∶15、提取 3 次，每次 40 min。石榴皮的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物对DPPH均有一定的抑制作用，其中正丁醇萃取物的抗氧化作用最强，说明石榴皮中抗氧化物质主要为极性较强的一类物质。经过D101大孔吸附树脂吸附，水洗去除无活性物质并用60%乙醇洗脱，分离得到石榴皮抗氧化成分纯化物。利用液质连用技术对石榴皮纯化物进行分析，得到石榴皮抗氧化成分主要是安石榴苷的两种异构体(α-安石榴苷和β-安石榴苷)。本实验研究所建立的提取和纯化石榴皮抗氧化成分的方法简单、实用，分离得到的安石榴苷可作为潜在的食品和化妆品添加剂，为其在更广泛领域的开发应用提供参考。

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