大黄药材蒽醌成分的HPLC指纹图谱研究

袁 晓，高俊飞，曹 建，舒楚金，袁 萍

中国科学院武汉植物园，武汉 430074

大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.唐古特大黄 Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。为《中国药典》2010年版第一部收载品种，是常用中药之一。主产于甘肃，青海，四川等省。其性微苦，微寒，归肝、胆、肺经。归脾、胃、大肠、肝、心包经。具有泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄之功效。大黄主要含蒽醌及其苷类、二苯乙烯类、鞣质及多糖类成分。大黄药材来源复杂，涉及不同种类和掺伪品，即便是同种正品也会因生长地域、采集时间、加工甚至贮存条件不同引起成分组成和含量的变化［1］.

本实验以不同产地药用大黄为建模对象，以梯度洗脱法对大黄药材进行指纹图谱研究，建立大黄的标准指纹图谱模型，并且充分考虑分析仪器的规范性、重现性及研究方法的代表性，建立不同品种大黄药材的标准图谱库和数据库。更深层次将大黄指纹图谱与药效相结合来控制大黄质量，为辨别药用大黄真伪，全面控制药用大黄质量提供了科学依据和更全面的质量控制信息［2，3］。

1 材料及仪器、试剂

1.1 仪器

L-2000高效液相色谱仪(日立公司生产);D-2000色谱工作站;5/25型低温冷却循环泵，制冷量为742～940 W，(巩义市予华仪器有限责任公司);JK-500B型超声仪(合肥金尼克机械制造有限公司生产)。

1.2 试药

乙腈为色谱纯，(美国Tedia公司生产)，其它试剂均为分析纯。大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素对照药材(中国药品生物制品检定所提供);大黄素-8-β-D-葡萄糖苷，大黄酸-8-β-D 葡萄糖，大黄酚-8-β-D 葡萄糖苷，大黄素甲醚-8-β-D-葡萄糖苷，白藜芦醇，二苯乙烯苷，1，6，8-3羟基-3-羧酸蒽醌，6-羟基芦荟大黄素由本实验室经硅胶柱、和C18柱层析得到，经核磁共振和红外、质谱仪器检测;确定化学结构，经液相色谱测定其纯度在98%以上。

1.3 生药样品来源

10个不同产地的大黄由2010年8月至10月从甘肃、四川、西藏.、河南、青海省收集，由中国科学院武汉植物园分类专家吴金清鉴定为掌叶大黄(Rheum palmatum L)、药用大黄(Rheum officinale Baill)、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf)。药材来源见表1。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱为YMC-ODS-AQC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈(A)-0.2% 磷酸水溶液(B)。流速1.0 mL/min，检测波长270 nm，柱温25℃，进样量10 uL，梯度洗脱程序:0 min(5%A)—35 min(40%A)-60 min(90%A)。

2.2 对照品的制备

分别精密称取干燥恒重的大黄酸，大黄酚，大黄素，大黄素甲醚，芦荟大黄素，大黄素-8-β-D-葡萄糖苷，大黄酸-8-β-D葡萄糖，大黄酚-8-β-D葡萄糖苷，大黄素甲醚-8-β-D-葡萄糖苷，白藜芦醇，二苯乙烯苷，1，6，8-3 羟基-3-羧酸蒽醌，6-羟基芦荟大黄素适量，置25 mL量瓶中，甲醇超声溶解，过0.45 um滤膜，即得［4］。

2.3 供试品溶液的制备

将药材粉碎，过50目筛，精密称取1.00克放入具塞锥形瓶中加30 mL甲醇，称重，超声30 min取出放冷，甲醇补失重量，提取液用0.45 μm微滤膜过滤，既得供试品溶液。

2.4 指纹图谱的方法学研究

2.4.1 精密度试验

精密称取干燥至恒重的DH1号药材粉末1.00 g，按2.3方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件进行测定，重复进样5次，测得各共有相对峰面积的RSD均小于3.00%，各色谱峰的相对保留时间在平均保留时间±1 min内，符合指纹图谱要求，表明仪器的精密度良好。

2.4.2 重复性试验

精密称取干燥至恒重的DH1号药材粉末5份，每份1.00 g，按2.3方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件进行测定，测定各共有峰的保留时间及峰面积RSD分别小于3.00%，表明该方法的重现性较好。

2.4.3 稳定性试验

精密称取干燥至恒重的DH1号药材粉末1.00 g，按2.3方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件测定其在 0、6、12、24、48 h 的色谱图，结果表明，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3.00%，表明在48小时内供试品溶液的成分是稳定的。符合指纹图谱的要求［5，6］。

3 结果

3.1 13个主要色谱峰的鉴定及参比峰的选择

供试品与对照品在同一设定好的梯度条件下进行测试，得到相应色谱图，通过保留时间及紫外光谱图比对，对指纹图谱中相应色谱峰进行指认［7］。结果为4号峰位为土大黄苷;5号峰为大黄酸-8-β-D葡萄糖;10号峰为白藜芦醇;12号峰为大黄素-8-β-D-葡萄糖苷;13号峰为6-羟基芦荟大黄素;14号峰为大黄酚-8-β-D葡萄糖苷;15号峰为1，6，8-3羟基-3-羧酸蒽醌;16号峰为大黄素甲醚-8-β-D-葡萄糖苷;20号峰为芦荟大黄素;21号峰为大黄酸;22号峰为大黄素;23号峰为大黄酚;24号峰为大黄素甲醚。其中23号峰大黄酚峰面积较大且较稳定故将其作为内参比峰(见图2)。

3.2 指纹图谱的建立

精密称取不同来源的药材粉末各1.00 g，按2.3方法配制成溶液，按2.1色谱条件进行测定，记录其HPLC图。通过10批次供试品溶液测定结果所给出的峰数、积分值和保留时间等相关参数，进行分析、比较，制定优化的大黄指纹图谱，共获得35个色谱峰，其中有24个共有特征峰，可作为判别大黄质量的群体特征峰。结果见图1。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件，制成大黄共有模式的对照指纹图谱见图2［8］。

3.3 不同来源的大黄相似度评价

图1 10批次大黄的HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprint of 10 specimens of Rheum

图2 10批不同产地大黄甲醇提取物的HPLC指纹图谱共有模式(23号峰大黄酚为参比峰)Fig.2 Common pattern of HPLC fingerprint of methanol extracts of 10 Rheum(chrysophanol as reference is represented by peak 23)

10种不同产地大黄的指纹图谱(图1)，利用夹角余弦原理和采用相对峰面积，以大黄酚为特征峰，求出24个共有峰面的相对保留时间和相对峰面积，结果见表2、表3。进行相似度计算。10批大黄药材指纹图谱的相似度分别为 0.941，0。933，0.993，0，982，0.963，0.988，0.933，0.978，0.915，0.956.结果表明，不同产地的10批次药用大黄的相似度为0.915 ～0.993 之间，均大于 0.9000，说明大黄指纹图谱具有比较好的稳定性和重复性，可作为大黄药材的具有专属性的指纹图谱［9，10］。

表2 大黄HPLC指纹图谱共有峰的相对保留时间比值Table 2 Retention time of common peaks of HPLC fingerprint of Rheum

21 0.819 0.820 0.820 0.819 0.819 0.820 0.820 0.819 0.819 0.819 0.819 0.066 22 0.917 0.918 0.919 0.917 0.916 0.917 0.918 0.917 0.917 0.918 0.917 0.084 23 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.000 24 1.045 1.045 1.046 1.045 1.044 1.045 1.045 1.044 1.045 1.045 1.045 0.063

表3 大黄HPLC指纹图谱共有峰的相对峰面积Table 3 Peak area of common peaks of HPLC fingerprint of Rheum

4 讨论

本实验建立了药用大黄的指纹图谱对各批样品的提取条件，结论为70%甲醇超声提取30 min效果最好，对色谱条件进行考察，发现在270 nm条件下大黄素，大黄素甲醚，芦荟大黄素，大黄酸，大黄酚有比较好的吸收，选择的YMC色谱柱，出峰数量多，分离度高，峰形对称性好，选择的洗脱梯度设置，其样品色谱峰分离度高，有35个峰形清晰可辨，符合指纹图谱要求。采用的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》对不同批次的大黄的HPLC指纹图谱进行了相似度评价，结果表明，其指纹图谱相互间较为吻合，但由于采集时间上存在差异，各批次的大黄有效成分的含量有一定的差别，24个共有峰明显且分离度较好，构成了大黄的指纹图谱，以共有模式作为大黄辨别真伪研究，能提供更全面的质量控制信息，具有参考价值。

1 Zhu ST(朱诗塔).Recent development on Rheum fingerprint.J Zhejiang Wanli Univ(浙江万里学院学报)，2010，23(2):77-79.

2 Qin C(秦晨)，et al.The study of main chemical constituents of Rheum species by HPLC-FPS.Modern instrum(现代仪器)，2000，3:8-11.

3 Liu X(刘欣)，et al.Study of Chromatography Fingerprint(CFP)of Dahuang.Anal Test Technol Instrum(分析测试技术与仪器)，2004，10:140-144.

4 Yuan ZB(袁倬斌)，Shang XY(尚小玉).Extraction，separation and determination the effective constituents from rhubarb and its effect of antimutagenesis.J anal sci(分析科学学报)，2002，18:508-51.

5 Yang HM(杨红美)，et al.Simultaneous determination of resveratrol，emodin，chrysophanol，physcion，in root of Polygonum cuspidatum and its extract by HPLC.Chin J Chin Mater Med(中国中药杂志)，2006，31:202-204.

6 Zou HB(邹华彬)，et al.Separation of the effective components from Rheum.Chem Anal Meterage(化学计量分析)，2002，11:13-15.

7 Wang R(王荣)，et al.Study on the fingerprints of different parts of rhubarb from genuine medicinal materials in Gansu.J China Pharm(中国药房)，2005，16:1435-1436.

8 Deng Y(邓颖)，et al.Comparison research of HPLC fingerprint on different products of Radix et Rhizoma Rheum.J Tradit Chin Med Univ Hunan(湖南中医药大学学报)，2011，31(3):39-42.

9 Zhang C(张村)，et al.HPLC simultaneous determination of two anthraquinone-O-glucosides in different botanical origins of rhubarb.Chin J Pharm Anal(药物分析杂志)，2010，30:53-55.

10 Qian H(钱慧)，Li N(李楠)，Cao YH(曹玉华).Fingerprint Development for Rheum palmatum by HPLC.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发).2008，20:1052-1054.