高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7片段互换嵌合病毒的构建及其生物学特性的分析

姜一峰，周艳君，王亚欣，朱建平，徐彦召，童 武，虞凌雪，童光志

(中国农业科学院上海兽医研究所猪病研究室，上海200241)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory virus，PRRSV)属于尼多病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，属单股正链RNA病毒[1]。基因组全长约15kb，5'端有帽子结构，3'端有polyA尾，病毒非结构蛋白编码区靠近5'端，占基因组全长约4/5，病毒结构蛋白编码区靠近3'端，部分结构蛋白基因首尾有部分重叠[2]。

PRRSV有9个开放阅读框(ORF)，分别为ORF1a、 ORF1b、 ORF2、 ORF2a、 ORF3、 ORF4、ORF5、 ORF6、 ORF7， 分 别 编 码 pp1ab、 pp1a、GP2、E、GP3、GP4、GP5、M、N蛋白[1-3]。最近的研究显示，在ORF4与ORF5上存在一个新的ORF，命名为ORF5a，编码新发现的结构蛋白GP5a[4-5]。ORF1a，ORF1b编码病毒的非结构蛋白，ORF2-7编码病毒结构蛋白。

2006 年，我国猪群中出现了一种变异的PRRSV，与经典的PRRSV相比毒力显著增强[6]，将该高致病性PRRSV(HP-PRRSV)在体外多次传代后毒力显著下降，而且对猪不致病[7]。本实验以HP-PRRSV强毒HuN4-F5及其体外传代致弱病毒HuN4-F112的感染性分子克隆为基础，将ORF1a，ORF1b，ORF2-73个大片段在强弱毒之间进行相互替换，以研究ORF1a，ORF1b，ORF2-7对病毒生物学特性的影响。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞及主要试剂 HP-PRRSV HuN4-F5株及其弱毒HuN4-F112株感染性分子克隆由本实验室构建[8-9]；BHK-21、Marc-145细胞由本实验室保存；羊抗鼠FITC荧光标记的IgG(FITC-TgG)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；转染试剂DMRIE-CReagent购自Invitrogen；DMEM、Opti-MEM培养基购自GIBCO公司；体外转录试剂盒mMessage High Yield Capped RNA Transcription kit购自Ambion公司；PRRSV阳性血清由本实验室制备保存；DL2000DNA Marker购自TaKaRa公司。

1.2 嵌合病毒的构建策略 HuN4-F5和HuN4-F112全病毒基因组分别被克隆在质粒pBluescriptⅡSK(+)中，选择PacⅠ(位于质粒上)和AscⅠ酶切位点作为强弱毒ORF1a互换所用酶切位点，NheⅠ和AscⅠ作为强弱毒ORF1b互换所用酶切位点，AscⅠ和NotⅠ(位于质粒上)作为强弱毒ORF2-7互换所用酶切位点(图 1)。

1.3 嵌合病毒基因组的体外转录 将PRRSV全基因组连接到质粒pBluescriptⅡ SK(+)时在3'末端引入了SwaⅠ酶切位点，在转染之前，将包含嵌合病毒全长基因组的质粒用SwaⅠ酶切线性化。体外转录按试剂盒操作说明进行，转录反应体系为：10μL 2×NTP/CAP，2μL Enzyme M ix，2μL 10×Reaction buffer，1μg线性化质粒模板，加无核酸酶水至20μL，置于37℃水浴锅中转录1h 45min。

1.4 嵌合病毒的拯救 按照转染试剂DMRIE-C Reagent操作说明方法，将转录产物转染细胞密度达到70%～90%的BHK-21细胞。37℃，5%CO2培养4h，吸出上清液，再加入2%～3%FBS的细胞维持液。24h后收取细胞，-80℃保存。

取转染后冻存的BHK-21细胞冻融离心后，上清接入6孔板内Marc-145细胞单层中，置CO2培养箱内孵育1h～1.5h后换含2%～3%FBS的细胞维持液。每5d为一代次进行拯救病毒传代培养，传5代直到细胞病变(CPE)出现为止。

1.5 拯救病毒的鉴定 本实验室在构建PRRSV HuN4-F5株和HuN4-F112株的感染性克隆时，将基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个M luⅠ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记。根据该酶切位点两侧的序列设计了一对PCR扩增引物，参照文献[8]和[9]方法鉴定。

1.6 间接免疫荧光试验(IFA) 将拯救的病毒接种于Marc-145细胞单层中，培养48h后，用80%乙醇固定30m in，以PRRSV阳性血清(1∶100稀释)为一抗，37℃作用1h，以羊抗鼠FITC-IgG为二抗，37℃避光作用1h，PBS洗涤后荧光显微镜下观察。

1.7 重组病毒生长曲线的绘制 将拯救的重组病毒以100TCID50感染M arc-145细胞，分别在感染后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h 和 96h收取 300μL细胞上清液，使用 100μL测定其TCID50，计算病毒滴度，根据不同时间点病毒的滴度绘制病毒生长曲线。TCID50的测定方法是将病毒液做连续10倍稀释(10-1～10-10)，然后接种于96孔培养板培养的MARC-145细胞单层上。每个稀释度接种8孔，即做8个重复。同时设两组阴性对照。在37℃5%CO2条件下培养，记录CPE情况。结果依据Reed-Muench法计算TCID50。

2 结果

2.1 PRRSV强弱毒嵌合病毒的拯救及鉴定 以HP-PRRSV HuN4-F5及其弱毒HuN4-F112的感染性分子克隆为骨架，将ORF1a、ORF1b和ORF2-73个基因片段相互替换，形成的6种嵌合病毒基因组，以强毒株为骨架的命名为HuN4-F5-ORF1a，HuN4-F5-ORF1b和HuN4-F5-ORF2-7；以弱毒株为骨架的分别命名为HuN4-F112-ORF1a，HuN4-F112-ORF1b和HuN4-F112-ORF2-7。将这些嵌合病毒基因组先转染BHK细胞，再在Marc-145细胞上传代，在5代内均出现CPE，表明已拯救出病毒。提取拯救病毒核酸，经RT-PCR扩增，M luⅠ酶切鉴定，结果出现两条带，表明获得的病毒为感染性分子克隆拯救获得的嵌合病毒(图2)。部分测序结果显示，ORF1a、ORF1b、ORF2-7都得到了正确的嵌合。

采用PRRSV阳性血清对拯救的重组病毒rHuN4-F5-ORF1a、 rHuN4-F5-ORF1b、 rHuN4-F5-ORF2-7、 rHuN4-F112-ORF1a、 rHuN4-F112-ORF1b、rHuN4-F112-ORF2-7进行IFA检测，拯救的嵌合病毒均能够被PRRSV阳性血清识别，出现特异性荧光反应(图 3)。

2.2 PRRSV强弱毒嵌合病毒在细胞上的生长特性将拯救的病毒按10倍稀释接种生长Marc-145细胞的96孔组织培养板，观察CPE，并按Reed-Muench法计算病毒滴度(表1)。以强毒株为骨架的重组病毒在Marc-145上的生长滴度都低于相应的以弱毒株为骨架的重组病毒。

表1 拯救的重组PRRSV在细胞上的生长滴度Table 1Replication titer of the rescued PRRSVs

测定各拯救病毒接种Marc-145细胞后96h内的生长曲线，结果显示，以强毒株为骨架的重组病毒除rHuN4-F5-ORF1a生长滴度显著升高以外，另外两个替换(rHuN4-F5-ORF1b和 rHuN4-F5-ORF2-7)与亲本病毒(rHuN4-F5)相比没有明显变化(图4A)。而以弱毒株为骨架的重组病毒除rHuN4-F112-ORF1b与亲本病毒(rHuN4-F112)相比没有明显变化以外，另外两个替换的重组病毒(rHuN4-F112-ORF2-7和rHuN4-F112-ORF1a)生长滴度均有显著下降(图4B)。

3 讨论

PRRSV基因组全长约15kb，非结构蛋白编码区约占基因组全长的4/5，另外1/5为结构蛋白编码区。非结构蛋白又可分为 ORF1a、ORF1b。在ORF1a中包含PRRSV两个重要的酶，nsp2和nsp4，他们负责切割多聚蛋白pp1ab和pp1a，形成14个非结构蛋白，这些非结构蛋白在PRRSV的复制中起重要作用[1,10,12]。Nsp1、nsp2可以抑制宿主干扰素的产生，调节机体免疫系统[11-13]。Nsp1进入细胞核参与了PRRSV各个复制阶段的串联作用[10-12]。Nsp2作为最大的非结构蛋白，在免疫调节以及病毒的复制以及病毒毒力变化上都起着重要作用[10,14-15]。Nsp3-8可能是的毒力基因[16]。ORF1b中包含RNA病毒复制起始的两个重要蛋白RdRP及解旋酶，他们组成了PRRSV复制起始的转录翻译复合体[17-18]。Nsp11作为内切核酸酶，需要严格的时间、位置限定，以避免切割病毒本身RNA，可能是潜在的自杀基因[10,19]。ORF2-7编码病毒的结构蛋白，在病毒的侵入细胞、进入细胞核、病毒释放以及免疫逃避中起重要作用[2,20]。

本实验分别以PRRSV HuN4强毒株及其传代致弱病毒HuN4F112株在感染猪时，强毒是致死性的，弱毒不致病；而在体外细胞培养时弱毒的增殖滴度明显高于强毒。比较强弱毒基因组序列时发现，弱毒株共有77个氨基酸发生突变，其中41个发生在ORF1a区，15个发生在ORF1b区，21个发生在ORF2-7。强弱毒的差异正是由于这77个氨基酸的突变决定的，因此本实验设计分别以强弱毒的感染性分子克隆为骨架，将这3个大片段在强弱毒之间互换，期望发现哪个功能区的变化将影响PRRSV在细胞中的适应性，进而影响病毒的致病性。结果发现以强毒株为骨架替换弱毒株的ORF1a后，在Marc-145中其增殖滴度显著提高，而以弱毒株为骨架替换强毒株的ORF1a后，在细胞中的增殖滴度显著下降，这表明ORF1a区与PRRSV在Marc-145细胞中的适应性密切相关。本实验结果将为进一步在体内研究ORF1a、ORF1b、ORF2-7的变化对PRRSV毒力的影响奠定了基础。

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