PEG对嗜水气单胞菌疫苗制备与免疫效果影响的研究

黄德贵，潘长旺，常彦祥

(温州医学院，浙江温州325035)

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是重要的人畜共患病，其内毒素常常引起发病，A.hydrophila感染动物及人时，在体内还可以产生较强的胞外毒力因子，引起肠道疾病，尤其以食物中毒方式引起肠道疾病[1]。针对该菌的疫苗研究国内外已有报道，但利用超声波结合PEG制备疫苗的研究未见报道。本实验主要研究在超声波的物理作用下，以PEG为佐剂制成的PEG结合疫苗对鱼类免疫系统生理指标的影响和免疫保护力的效果，为相关学术研究及水产病害的防治提供借鉴与参考。

1 材料和方法

1.1 菌 种A.hydrophila采用微量生化鉴定管法从温州某农贸市场花蛤中分离筛选并鉴定。

1.2 试验用鱼 锦鲤(Cryprinus carpiod)为同源种群，体质量为180±20 g，体长为16±3 cm，养殖水温24℃～26℃，实验前驯养一周。

1.3 疫苗的制备A.hydrophila接种LB培养基，30℃恒温振荡培养24 h，离心收集菌体，用无菌PBS(pH7.4)洗涤3次，制成浓度1×108cfu/mL的菌液，备用。

福尔马林(FM)灭活疫苗(常规疫苗)：用0.15%福尔马林灭活，4℃过夜，离心收集菌体，用无菌PBS(pH7.4)洗涤3次，制成浓度1×108cfu/mL的菌液，备用。

超声灭活疫苗：经前期试验，25%PEG6000、PEG200菌液在冰浴中进行间歇超声后结合菌体最多，因此以 25%PEG6000、PEG200，超声功率300 W，超声时间设置为工作2 min，间歇1 min，总时长45 min进行超声灭活。

1.4 疫苗接种 每种疫苗分别接种70尾健康锦鲤，腹腔注射0.2 mL/尾，分4组：PEG6000组、PEG200组、FM组、对照组(注射PBS)，共需280尾锦鲤。第一次接种30 d后，进行第二次接种，疫苗的浓度是初次的5倍，腹腔注射0.2 mL/尾。

1.5 免疫指标的测定 二次免疫后，每隔10 d从各试验组随机取10尾鱼，尾静脉取血，每尾0.6±0.1 mL。全血室温静置3 h后，于4℃过夜，离心收集血清，分装，-20℃贮存备用；另外，取适量全血用肝素抗凝后备用。

血清杀菌活性测定参照李春猛的方法[2]并做适当的改动，计算细菌存活指数(SI)：

SI=(取样时刻的细菌数/零时刻的细菌数)×100。公式中零时刻既开始计时的时刻。

血细胞吞噬活性测定参照陈孝煊的方法[3]并适当改进，计算吞噬百分率及吞噬指数。

吞噬百分率=吞噬了细菌的血细胞数/血细胞总数×100%

吞噬指数=血细胞吞噬的细菌总数/吞噬了细菌的血细胞数

抗菌活性测定采用Boman及Hultmark的方法[4]进行。抗菌活力按[(Ao-A)/A]1/2式计算。公式中：Ao为样品零时刻吸光度；A为样品反应后吸光度。抗体效价的测定采用96孔血凝板，用微量凝集反应测定抗体效价[5]。为方便统计，抗体效价以Log2(血清稀释倍数)表示。

1.6 攻毒试验 免疫接种后第45 d，每组取20尾锦鲤，腹腔注射0.5 mL浓度为2.3×108cfu/mL的活菌液，连续观察一周，计算免疫保护力(相对百分存活率RPS)。

RPS=(1-受免鱼死亡率/对照鱼死亡率)×100%

2 结 果

2.1 免疫血清的杀菌活性试验 将抗凝血浆与嗜水气单胞菌悬液混合，25℃下孵育2 h后取样，平板计数(图1)。试验组均明显著(p<0.05)高于对照组，特别是在二次免疫后(30 d后)免疫鱼杀菌活力明显升高。PEG6000组血清杀菌活力显著高于PEG200组(p<0.01)与 FM组(p<0.05)。

2.2 粒细胞吞噬活性试验 取抗凝血浆与金黄色葡萄球菌悬液混合，25℃下孵育1 h后离心，去上清，平板计数(图2、图3)。3个试验组吞噬百分率(pPEG6000<0.01，pPEG200<0.01，pFM<0.05)和 吞 噬 指 数(pPEG6000<0.01，pPEG200<0.05，pFM<0.01)显著高于对照组。PEG6000组吞噬百分率与吞噬指数(p<0.01)显著高于PEG200组和FM组(图2、3)。

2.3 血清抗菌活性试验 将血清与大肠杆菌悬液混合测定反应前后的吸光度，根据公式计算抗菌活性(图4)。各组抗菌活力的变动幅度较大，均有一定的抗菌能力，尤其两次注射疫苗后10 d的抗菌活力相对较高。差异分析结果：3个试验组抗菌活力均显著高于对照组(pPEG6000<0.01，pPEG200<0.05，pFM<0.05)；PEG6000显著高于FM(p<0.01)。

2.4 血清抗体效价测定 采用血凝板法，将血清倍比稀释，以发生凝集的最高稀释度为效价(图5)，3种疫苗都可以刺激锦鲤产生抗体，其中PEG6000组抗体产量最高，PEG200组最差。3个试验组抗体效价均显著高于对照组(p<0.01)；PEG6000组显著高于另外3组(p<0.01）。

2.5 免疫保护力测定 试验组和对照组进行攻毒，观察统计死亡情况，按公式计算免疫保护力(表1)，PEG6000组免疫保护力(RPS)是77.8%，显著高于FM 组(p<0.05)、PEG200 组(p<0.01)与对照组(p<0.01)。FM组的RPS为55.6%；PEG200组的RPS为44.4%。

表1 嗜水气单胞菌攻毒后锦鲤的累计死亡率Table 1 Protections of Brocarded Carp after challenge withA.hydrophila

3 讨 论

国外利用PEG作为交联剂或载体的研究已有很多，Singh等将带有HIV-1抗原决定簇的脂质体(Liposome)连接在PEG分子上，来延长脂质体在体内的寿命，结果显示该脂质体-PEG复合物可以使机体提高2倍免疫反应能力，延长抗体持续释放的时间[6]。Christie等用修饰的和未修饰的PEG制成掺有活疫苗的凝胶，注入糜鹿体内，采用荧光法检测疫苗释放情况，PEG-乙交酯在第10 d将疫苗完全释放，PEG-丙交酯在第45 d完全释放，而单纯PEG即使在45 d后也未释放疫苗[7]，但该研究并未比较3种弹头对机体免疫应答的影响。

单核细胞与中性粒细胞的吞噬作用是虹鳟等鱼类主要的非特异免疫机制之一[8]。研究表明，鱼类嗜中性粒细胞是体内的吞噬细胞，在一定情况下是一种重要的吞噬细胞，鲽鱼(Kareius bicoeoratas)机体发生炎症时，其嗜中性粒细胞活跃地向炎症部位迁移并大量吞噬病原体[9]。在本研究中，体外观察到锦鲤的血细胞能吞噬多个金黄色葡萄球菌，且其吞噬百分比和吞噬指数均从注射疫苗后显著增加，尤其PEG6000组，在整个免疫过程中吞噬百分比和吞噬指数平均分别比对照组提高了18.36%和2.7%，表明疫苗对锦鲤机体非特异性细胞免疫系统进行了有效的刺激，与宋颖等对豚鼠气单胞菌疫苗的研究结果相似[10]。

本研究的3种疫苗在攻毒试验中对锦鲤的保护力有一定的差异，PEG6000超声疫苗对锦鲤保护力达77.8%，是3组中最高的。可见PEG6000在疫苗对机体免疫刺激中发挥着十分重要的作用。PEG是一种惰性的、无毒的安全载体，PEG疫苗在体内释放的抗原速率缓慢[7]，保证了疫苗刺激机体免疫系统的长效性，因此使各项免疫指标得到强化。

[1]杨守明.几起嗜水气单胞菌引起的食物中毒流行病学特征分析[J].中华疾病控制杂志.2009，13(2)：206-207.

[2]李春猛，战文斌，马生生.中国对虾血淋巴抗菌活力的测定[J].青岛海洋大学学报，1999，29(4)：599-603.

[3]陈孝煊，吴志新，张厚梅.大黄与黄连对二种淡水虾血细胞吞噬活性的影响[J].水生生物学报，2002，26(2)：201-204.

[4]Hultmark D,Engstrom A,Bennich H,et al.Insect immunity:isolation and structure of cecropin D and four minor antibacterial components from Cecropia pupae Hyalophora cecropia[J].Eur J Biochem,1982,127(1):207-217.

[5]Sinisterra J V.Application of ultrasound to biotechnology:an overview[J].Ultrasonics,1992,30(3):180-185.

[6]Singh S K,Bisen P S.Adjuvanticity of stealth liposomes on the immunogenicity of synthetic gp41 epitope of HIV 1[J].Vaccine,2006,24(19):4161-4166.

[7]Christie R J,Findley D J,Dunfee M,et al.Photopolymerized hydrogel carriers for live vaccine ballistic delivery[J].Vaccine,2006,24(9):1462-1469.

[8]Passantino L,Tafaro A,Altamura M,et al.FishimmunologyⅡ.Morphologycal and cytochemical characterization and phagocytic activitiesofhead kidney macrophagesfrom rainbow trout(Salmo gaidneri Richardson)[J].Immunopharmacol Immunotoxicol,2002,24(4):679-691.

[9]Kollner B,Kotterba G.Temperature dependent activation of leu-cocyte populations of rainbow trout,Oncorhynchus mykiss,after intraperitoneal immunization with Aeromonas salmonicida[J].Fish Shellfish Immunol,2002,12(1):35-48.

[10]宋颖，关万春，易鹏，等.豚鼠气单胞菌超声灭活PEG结合疫苗的制备及免疫效果[J].浙江农业学报，2010，22(2)：177-182.