鸭坦布苏病毒研究进展

朱丽萍，颜世敢

(1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南250353；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南250100)

2010年4月以来，我国主要蛋鸭养殖区福建、山东、浙江、上海、江苏等地陆续暴发一种以蛋鸭、种鸭产蛋骤然大幅下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征的急性传染病，造成约1.2亿只蛋鸭和1500万只肉鸭发病，经济损失达数十亿元。根据主要病变和临床特点，曹贞贞等将该病命名为鸭出血性卵巢炎(Duck hemorrhagic ovaritis，DHO)[1]。少数学者提出了鸭病毒性脑炎、鸭鹅脑炎-卵巢炎综合征、鸭传染性产蛋减少症等名称[2-4]。随着病原学研究的深入，该病被确诊是由一种新型黄病毒-鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)引起[1-10]。2011年中国畜牧兽医学会第一届水禽疫病防控研讨会将该病名称统一为“鸭坦布苏病毒病”。本文对DTMUV的病原学特性、分子生物学特性、致病性、检测方法等最新研究进展进行综述。

1 DTMUV的理化特性和培养特

DTMUV病毒粒子呈球形，大小45 nm～50 nm，有囊膜，表面有纤突[1-4,8-10]。DTMUV对乙醚、氯仿及去氧胆酸盐敏感[2,4,10]。病毒不耐热，50℃以上加热60分钟活性丧失[4]。适宜pH范围为6～9，pH<5或pH>10时感染性丧失[4]。DTMUV不能凝集鸡、鸭、鹅、鸽、鼠、兔、猪和人的红细胞[1-2,4-6,8-9]。

DTMUV能在鸭胚、鸡胚、鸭胚成纤维细胞及Vero细胞中增殖，不能在鸡胚成纤维细胞中生长[2,4,10]。DTMUV主要在感染细胞的胞浆内复制[10]。经尿囊腔接种，鸭胚3 d～5 d后死亡，表现为绒毛尿囊膜增厚、水肿，胚体水肿、出血，胚肝肿大、斑驳状坏死。DTMUV易适应鸭胚成纤维细胞培养，并产生细胞病变(CPE)，表现为折光性增强，细胞变圆及融合，最终崩解死亡[2,4,10]。DTMUV能在Vero细胞上增殖，盲传至第3代可产生CPE[4]。

2 DTMUV的基因组及其编码蛋白质

DTMUV的基因组为不分节段的具有感染性的单股正链RNA，由10 990个核苷酸(nt)组成[11]。基因组由5'端和3'端非编码区(UTR)及一个开放阅读框(ORF)组成，基因组的顺序为5'-UTR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4ANS4B-NS5-UTR-3'。结构蛋白编码位于基因组5'端，非结构蛋白编码区位于3'端。5'端UTR长为142 nt，有一个I型 m7GpppNp帽子结构。3'端 UTR长 618 nt，无 poly(A)结构。UTR是黄病毒基因组复制起始调控位点，影响病毒的复制、翻译及其致病性。DTMUV的5'端、3'端UTR与Bagaza病毒的 5'端、3'端 UTR同源性分别为76.3%和77.4%。多数黄病毒的3'端UTR含有长度约为20 nt的保守序列，DTMUV的3'端UTR含有3个保守序列(CS1、CS2、CS3)，长度分别为 25 nt、23 nt和 28 nt，其中CS2和CS3为串联重复序列(RCS)，从5'→3'依次为RCS3-CS3-RCS2-CS2-CS1[11]。CS的组成形式是区分黄病毒属由哪种传播媒介传播的重要依据，蚊传播的黄病毒常含有 CS1[12-13]。

DTMUV的ORF包含10 230 nt，编码长度为3 410个氨基酸的多聚蛋白前体，多聚蛋白前体在宿主信号肽酶和病毒丝氨酸蛋白酶的催化下切割成为3种结构蛋白(核衣壳蛋白C、膜蛋白prM和囊膜蛋白E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)，分别由 105、167、501、404、164、131、628、129、250、910个氨基酸组成[11]。预测prM、E、NS1、NS2A、NS4B和NS5蛋白分别具有2、2、3、1、2和7个N-连接糖基化位点[11]。C蛋白的氨基酸同源性低，含有大量的碱性氨基酸，参与病毒组装过程。E、NS1、NS3、NS5蛋白具有保守性和抗原性。E蛋白是DTMUV主要表面蛋白，具有促使病毒与宿主细胞结合及膜融合功能，能诱导产生中和抗体。DTMUV的非结构蛋白NS1是黄病毒中最大的，是病毒感染过程中产生的主要免疫原，但 NS1免疫不能诱导无明显的抗病毒抗体产生，发生抗体增强效应的可能性较小[11]。NS3蛋白具有丝氨酸蛋白酶、核苷三磷酸酶/RNA解旋酶活性，参与蛋白质水解加工及病毒复制，与病毒的致病性密切相关[14]。NS3与NS2组成病毒复制体，感染动物可产生抗NS2-3抗体，但抗NS2-3抗体不具有病毒中和活性[14]。

3 DTMUV的遗传进化分析

黄病毒科包括黄病毒属、瘟疫病毒属、肝炎病毒属。黄病毒属是该科中最大的家族，分为登革热病毒群、日本脑炎病毒群、黄热病病毒群、恩他耶病毒群(Ntaya virus group)等8个血清学亚群，包含约70种病毒。国际上对黄病毒属成员的分类标准为NS5基因3'端长约1 kb的区域中同种病毒的核苷酸序列同源性大于84%。鸭出血性卵巢炎的病原与恩他耶病毒群的坦布苏病毒(Tembusu virus，TMUV)印尼和泰国病毒株的核苷酸同源性为87%～91%，氨基酸同源性为98%～99%；而与同群的Ntaya病毒、Sitiawan病毒、Theiler's murine encephalomyelitis virus(TMEV)、Bagaza病毒的核苷酸同源性大于70%，因此确定该病原为黄病毒科黄病毒属恩他耶病毒群的TMUV。

截至2011.12.15日，GenBank数据库收录了9株鸭源、1株鹅源、1株鸡源共11株DTMUV的基因序列，病毒株名称及其GenBank登录号分别为YY5株(HQ641390.1)[1,15]、 duck/SD/CHN/2010 株 (JF738022.1)[2]、BYD-1 株(JF312912.1)[8,10]、Fengxian 株(HQ833331.1)[9,16]、CJD05/CHN/2010 株(JF795477.1)[17]、Huabei株(JF523187.1)[18]、HBJL 株(JF423123.1)、JS804 株(NC015843.1)[3]、muscovy/SD/China/2011 株(JN232077.1)、FS 株(JN811558.1)、JM 株(JN811559.1)。其中 BYD-1、JS804、FS、JM、muscovy/SD/China/2011、CJD05等6株病毒完成了全基因组或聚蛋白基因序列分析。11株DTMUV的多聚蛋白、NS5、E基因核苷酸序列同源性均大于98%。E基因遗传进化分析发现，11株 DTMUV分属于2个分支，其中 CJD05、Fengxian、JS804、muscovy/SD/China/2011等4株的亲缘关系相近，与泰国蚊源株THCar同属一个分支；而BYD-1、FS、JM、duck/SD/CHN/2010等4株的亲缘关系相近，属于另一个分支。NS5基因遗传进化分析结果表明，11株DTMUV分属于2个分支，其中Huabei与其它10株亲缘关系较远，与Tembusu virus note N2 revived 14/6/82同属一个分支；而其它10株的亲缘关系相近，与泰国蚊源株THCar同属于一个分支(图1)。NS5和E基因进化分析结果提示我国的DTMUV源头可能来自东南亚，而不同地区流行病毒株存在遗传变异情况。

4 DTMUV的传播

在自然条件下，黄病毒属的成员主要经节肢动物传播。黄病毒属的70多个成员中有30种由蚊传播，11种由蜱传播，其余的媒介尚不清楚。恩他耶病毒群的病毒均为虫媒传播。主要成员Ntaya病毒分离自蚊子，可感染小鼠和人[19-20]。TMUV为库蚊传播，鸟类特别是家禽为其贮存宿主[21]。TMEV由火鸡中分离，可造成火鸡共济失调、瘫痪，种火鸡感染后产蛋下降[22]。从发病肉鸡分离的Sitiawan病毒(TMUV Sitiawan株)，能造成鸡斜颈、震颤、转圈等神经症状[23]。过去有TMUV感染蚊子、鸡及人的报道，而无水禽感染的病例报道。因此，推测我国目前流行的鸭出血性卵巢炎是由TMUV感染新宿主引起的一种新发传染病。

DTMUV的具体传播媒介不明。DTMUV在秋季流行严重，推测可能与蚊虫有关，但进入蚊虫较少的冬季后，该病仍然在山东部分地区蔓延，因此，是否有其他的传播途径有待进一步证实。

从鸭场内死亡麻雀体内检出DTMUV，提示病毒可经鸟类传播。病鸭的卵泡膜中DTMUV的检出率高达93%，DTMUV是否经卵垂直传播还有待验证。从泄殖腔可分离到病毒，表明该病毒能经粪便排毒，污染环境、饲料、饮水、器具、运输工具等而造成传播[7]。不同地区间调运感染鸭易造成该病大范围和快速传播。

5 DTMUV的致病性

DTMUV可自然感染除番鸭外的所有品种产蛋鸭，包括蛋鸭(如绍兴鸭、缙云麻鸭、山麻鸭、金定鸭、康贝尔鸭、台湾白改鸭)、肉种鸭(如樱桃谷鸭和北京鸭)及野鸭等[5]。有产蛋鸡[17]、鹅自然感染发病的报道[3]。人工肌肉注射或滴鼻接种分离的病毒在雏鸭[2]、蛋鸭[1,8]、雏鸡[4]、雏鹅[3]中成功复制出该病并回收到病毒。

鸭坦布苏病毒病发病突然，传播迅速。感染蛋、种鸭主要表现为采食量突然大幅下降，产蛋随之大幅下降，由高峰期的90%～95%下降至5%～10%。发病率高达100%，死淘率5%～15%，继发感染时死淘率可达30%。体温升高，排绿色稀粪。在流行的早期，病鸭一般不出现神经症状；而在流行的后期，神经症状明显，表现瘫痪、行走不稳、共济失调。病鸭所产种蛋受精率降低10%左右。病程为1～1.5个月，可自行逐渐恢复。发病后15 d～20 d采食量开始恢复，绿色粪便逐渐减少，产蛋率缓慢上升。体质好的鸭群，尤其是刚开产和产蛋高峰期的鸭群，可恢复到发病前产蛋水平。蛋鸭恢复后期多数有一个明显的换羽过程[1,5,8]。

商品肉鸭和育成期的种鸭可在20日龄前发病，以神经症状为主，表现站立不稳、倒地不起、行走不稳，病鸭有饮、食欲，但多数因饮水、采食困难衰竭死亡，死淘率10%～30%[2]。

感染鸭的主要病变出现在卵巢，表现为卵巢出血、萎缩、破裂，卵泡膜充血、出血，卵泡充血、变性、坏死或液化，蛋黄破裂、卵黄性腹膜炎。输卵管有粘液性渗出。有的肝脏肿大、淤血，表面有针尖状白色点状坏死。脾脏斑驳呈大理样，有的极度肿大并破裂。胰腺出血和坏死。心肌外观苍白，有白色条纹状坏死，有的心肌外壁、内膜出血。表现神经症状的病鸭则脑膜出血，脑组织水肿、呈树枝状出血。有的育成鸭还出现腺胃乳头出血。病理组织学变化主要有出血性卵巢炎、间质性肝炎、非化脓性脑炎[1-2,5,8,18]。

6DTMUV的检测

目前，DTMUV检测主要依赖病毒分离和分子生物学检测。

病毒分离是DTMUV的传统检测方法。病鸭的卵泡膜、脑、脾脏、肝脏等病变组织适宜分离病毒，卵泡膜中最易分离和检测到病毒[18]。DTMUV在鸭胚、鸡胚、鸭胚成纤维细胞及Vero细胞中初次分离的成功率仅为20.6%，低于临床样品RT-PCR检出率[26]。初次病毒分离阴性时继续盲传3代。

DTMUV的分子生物学检测方法有RT-PCR、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR、RT-LAMP等。Maher-Sturgess等根据报道的257个黄病毒的NS5基因中编码甲基转移酶和聚合酶基因的核苷酸序列设计了一对可检测所有黄病毒成员的通用兼并RT-PCR引物，上游引物为AAYTC IACICAIGARATGTAY，下游引物为 CCIARCCACATRW ACCA，扩增片段大小为800 bp[24]。胡旭东等、万春和等和Cao等分别根据E、NS3基因保守序列，设计引物，建立了可直接检测感染鸭组织中DTMUV的特异、敏感的RT-PCR检测方法[10,25,15]。颜丕熙等建立的套式RT-PCR方法，灵敏度比常规PCR高10倍，临床样品阳性检出率高于病毒分离率[26]。Yan等建立了TaqMan探针荧光定量PCR方法，灵敏度是常规PCR的100倍[27]。Tang等建立的 RT-LAMP检测法，灵敏度达 10拷贝/μL，检测只需45 min[28]。

黄病毒的血清学检测方法有ELISA、琼扩试验、血凝抑制试验、补体结合试验和中和实验等。姬希文等以纯化的FX2010株作为包被抗原，建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA法，敏感性和特异性较高，阴阳性临界值判定标准为0.432[29]。

7 展望

全球气候变暖造成近二十年间黄病毒传播速度加快，打破了原有的地理分布界限和宿主物种界限，不断有新型黄病毒被发现的报道。DTMUV是在我国首次发现的对水禽致病的新型黄病毒，传播迅速、对鸭鹅危害大，应引起世界范围内的足够重视。

我国兽医工作者在DTMUV研究领域取得了重要进展，完成了病毒的分离鉴定及全基因组测序，建立了分子生物学检测方法及实验感染模型。但是在DTMUV的致病机理、跨物种传播机制及疫苗研制方面还存在很多迫切需要解决的难题，如DTMUV的传播媒介到底是什么？是哪些氨基酸位点的突变导致DTMUV对鸭的致病性增强？多数黄病毒感染人、畜禽后缺乏特征性的症状和病变，易与其它发热性传染病相混淆，应加强DTMUV的流行病学调查，尽快搞清DTMUV是否感染人及除鸭以外是否还感染其它宿主？

目前尚无有效防制DTMUV的商品化的疫苗。鸭感染DTMUV后可检测出低效价的中和抗体[4,8]，鸡对DTMUV也能产生特异性免疫应答反应[17]，这表明DTMUV具有一定的抗原性。筛选抗原性良好的天然疫苗株，研制免疫效果确实的灭活疫苗或弱毒活疫苗是全病毒疫苗研发的主要途径。在DTMUV全基因组测序和基因功能鉴定的基础上，利用反向遗传操作技术构建感染性克隆，研制基因工程疫苗也是DTMUV新型疫苗研发的重要途径。尽快建立综合防治措施，有效控制DTMUV的流行和传播，公共卫生意义重大。

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