神经节苷脂诱导胶质瘤细胞自噬性死亡

马明明，王雪晶，丁雪冰，张钱林，贺 爽，张杰文

(1．河南省人民医院神经内科，河南郑州450003;2．郑州大学第一附属医院神经内科，河南郑州450052;3．河南省人民医院肾脏内科，河南郑州450003)

神经节苷脂诱导胶质瘤细胞自噬性死亡

马明明1，王雪晶2，丁雪冰3，张钱林1，贺 爽1，张杰文1

(1．河南省人民医院神经内科，河南郑州450003;2．郑州大学第一附属医院神经内科，河南郑州450052;3．河南省人民医院肾脏内科，河南郑州450003)

目的 探讨神经节苷脂(GM1)对恶性脑胶质瘤细胞U251自噬性死亡的影响。方法 GM1作用U251细胞后，应用MTT法检测细胞的存活率，流式法检测细胞凋亡的改变，荧光显微镜下观察MDC染色后细胞质内酸性自噬泡的形成情况及外源性LC3-Ⅱ的表达;Western blotting法检测细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、Lamp-2a、Beclin-1的表达。结果 与对照组相比，GM1作用48 h后，U251细胞存活率明显降低，且具有剂量依赖性，差异有统计学意义(P＜0．05);与对照组相比，GM1作用48 h后，U251细胞凋亡率明显升高，且具有剂量依赖性，差异有统计学意义(P＜0．05);GM1作用后细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、Lamp-2a及Beclin-1的表达水平明显上调，差异有统计学意义(P＜0．05)。结论 GM1可以诱导恶性脑胶质瘤细胞U251自噬性死亡，为恶性脑胶质瘤的治疗提供新的方向。

自噬性死亡;神经节苷脂;U251细胞

神经节苷脂(monosialotetrahexosy 1 ganglioside，GM1)是哺乳类动物细胞膜的重要组成部分。以往研究［1]证实外源性GM1入血后，与脂蛋白结合，可通过血脑屏障进入中枢神经系统，并能够高度浓集于受损病灶区域，参与神经修复及重构的病理过程，从而促进神经细胞功能的恢复。胶质瘤是最常见的颅内原发肿瘤，目前研究［2]已证实GM1能够诱导胶质瘤细胞凋亡，但具体机制仍未明。本实验以脑胶质瘤U251细胞为研究对象，探讨GM1通过调控U251细胞自噬水平诱导其凋亡的具体机制。

1 材料与方法

1．1 细胞培养 人脑胶质瘤细胞系U251购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，常规培养于含体积分数12%胎牛血清的DMEM完全培养液中，置于37℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养，每1～2天换液1次。待细胞铺满培养瓶底90%后，以消化液(含质量分数0．30%胰蛋白酶和质量分数0．05%EDTA)消化，1∶4 比例稀释、培养。

1．2 MTT法检测细胞存活率 U251细胞接种于96孔板(密度为3×103/孔)，次日对照组给予常规DMEM培养液，实验组分为5个浓度组，分别加入0、50、100、250 μg·mL－1的 GM1，每组设4 个复孔，培养48 h，弃去培养液，每孔加10 μL MTT和90 μL无血清DMEM培养液，37℃孵育2 h，弃去液体，加入150 μL DMSO振荡溶解，酶标仪于570 nm波长处测量吸光度(A)值，细胞存活率(%)=实验组A值/对照组A值×100%。

1．3 流式细胞仪检测细胞凋亡 实验组加入0、50、100、250 μg·mL－1GM1，培养48 h 后，收集细胞，冷的PBS洗涤后弃去上清，重悬细胞于Annexin结合缓冲液，每份标本容量为120 μL，加入8 μL Alexa Fluor 488 AnnexinⅤ和 2 μL 100 μg·mL－1PI工作液，室温下孵育15 min，向标本中加入400 μL Annexin结合缓冲液，在冰上轻轻混匀，立即将标本用流式细胞仪分析。

1．4 Western blot法分析蛋白表达 250 μg·mL－1GM1给药24、48 h后收集细胞，提取总蛋白并检测。经SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜后封闭，一抗4℃过夜，加入HRP标记的二抗，杂交炉孵育2 h，暗室中行X线胶片曝光，GAPDH设为内参。

1．5 细胞免疫荧光化学检测 U251细胞培养于12孔板内，孔内预置入无菌盖玻片。质量分数4%多聚甲醛固定5 min，质量分数15%BSA(0．25%TritoX-100)封闭，PBS洗3 次，加入 Hochest33258(1∶10 000)，孵育3 min，用Olympus IX70荧光显微镜观察。

1．6 统计学处理 采用SPSS 13．0进行分析，计量资料以¯x±s表示，组间比较采用t检验，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 GM1对U251细胞存活率的影响 MTT法检测结果显示:0、50、100、250 μg·mL－1GM1 作用 48 h后，U251 细胞存活率分别为(98．0 ±8．2)%、(79．3 ±12．2)%、(62．2 ±14．3)%、(51．2 ±7．3)%;与对照组比较，差异有统计学意义(P均＜0．05)。见图1。

2．2 GM1 对 U251 细胞凋亡的影响 0、50、100、250 μg·mL－1GM1 作用48 h后，U251 细胞凋亡率为(2．1±0．3)%、(4．0 ±0．5)%、(20．1 ± 8．1)%、(40．2 ±7．0)%;与对照组比较，差异有统计学意义(P均＜0．05)。见图 2。

2．3 Western blot分析 LC3、Lamp-2a、Beclin-1 水平的变化 GM1上调 LC3-Ⅱ表达水平，250 μg·mL－1GM1给药0、24、48 h后，LC3-Ⅱ表达水平逐渐上调，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐渐上调，明显高于对照组(P＜0．05);与对照组相比，Lamp-2a表达水平逐渐上调(P＜0．05);与对照组相比，Beclin-1表达水平逐渐上调(P ＜0．05)。见图3。

2．4 免疫荧光显示自噬体形成和LC3-Ⅱ表达 荧光显微镜下可见，250 μg·mL－1GM1 给药 0、48 h 后，U251细胞内出现LC3-Ⅱ表达高亮点，呈颗粒状聚集，说明自噬体形成，而对照组无此现象。见图4。

3 讨论

细胞有2种死亡方式:细胞坏死和程序性细胞死亡，其中程序性细胞死亡有Ⅰ型(细胞凋亡)和Ⅱ型(自噬性细胞死亡)2种［3]。自噬是指溶酶体降解利用细胞内物质成分的过程［4]。细胞自噬的主要生理功能是及时清除细胞中产生的"垃圾"(如破损或衰老的细胞器、折叠错误的蛋白质等)，维持细胞内稳态。因此，无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础低水平的自噬活性对细胞的生理活动至关重要，但过度细胞自噬则引起细胞的过量损伤导致细胞死亡［5]。

神经系统原发性肿瘤60%为胶质瘤，恶性胶质瘤预后差，平均生存周期不超过1 a［6]。手术是胶质瘤的主要治疗方式，但侵袭到远处的瘤细胞，往往难以清除，是复发的根源。其他治疗手段如放疗、化疗对抑制胶质瘤的发展具有重要意义。越来越多的体内及体外实验均证实自噬的调控在各种药物过程中发挥了重要作用。替莫唑胺能够诱导恶性胶质瘤细胞发生自噬，3－甲基腺嘌呤在抑制替莫唑胺诱导自噬的同时也削弱了其抗肿瘤效应;而 bafilomycin A1则通过活化caspase-3诱导凋亡增强了替莫唑胺的抗肿瘤效应［7]。三氧化二砷和神经酰胺通过上调线粒体的细胞死亡蛋白BNIP3诱导恶性神经胶质瘤细胞发生自噬性细胞死亡［8]。姜黄素能够抑制该通路诱导自噬性恶性胶质瘤细胞死亡从而产生抗肿瘤效果［9]。原人参萜二醇同样能够降低Akt磷酸化水平从而诱导胶质瘤细胞系U87MG发生自噬性死亡［10]。本研究发现，随着GM1浓度的增加U251细胞存活率明显降低，凋亡率逐渐增加。进一步研究证实，随着GM1浓度的增加可诱导U251细胞巨自噬及分子伴侣介导自噬的发生，从而导致胶质瘤细胞U251自噬性死亡。总之，本研究结果表明，GM1通过诱导自噬抑制了U251细胞的生长，促进细胞自噬性死亡过程;为GM1治疗恶性脑胶质瘤提供了新的理论依据。

［1]Karpiak SE，Mahadik SP．Reduction of cerebral edema with GM1 ganglioside［J]．J Neurosci Res，1984，12(2/3):485 － 492．

［2]Ledeen RW，Wu G．GM1 ganglioside:another nuclear lipid that modulates nuclear calcium．GM1 potentiates the nuclear sodiumcalcium exchanger［J]．Can J Physiol Pharmacol，2006，84(3/4):393－402．

［3]Bursch W．The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death［J]．Cell Death Differ，2001，8(6):569 － 581．

［4]Sapunar D，Vilovic K，England M，et al．Morphological diversity of dying cells during regression of the human tail［J]．Ann Anat，2001，183(3):217 －222．

［5]Li F，Vierstra RD．Autophagy:a multifaceted intracellular system for bulk and selective recycling［J]．Trends Plant Sci，2012．

［6]Schwartzbaum JA，Fisher JL，Aldape KD，et al．Epidemiology and molecular pathology of glioma［J]．Nat Clin Pract Neurol，2006，2(9):494－503．

［7]Kanzawa T，Germano IM，Komata T，et al．Role of autophagy in temozolomide-induced cytotoxicity for malignant glioma cells［J]．Cell Death Differ，2004，11(4):448 －457．

［8]Kanzawa T，Zhang L，Xiao L，et al．Arsenic trioxide induces autophagic cell death in malignant glioma cells by upregulation of mitochondrial cell death protein BNIP3［J]．Oncogene，2005，24(6):980－991．

［9]Shinojima N，Yokoyama T，Kondo Y，et al．Roles of the Akt/mTOR/p70S6K and ERK1/2 signaling pathways in curcumin-induced autophagy［J]．Autophagy，2007，3(6):635 －637．

［10]Liu GY，Bu X，Yan H，et al．20S-protopanaxadiol-induced programmed cell death in glioma cells through caspase-dependent and-independent pathways［J]．J Nat Prod，2007，70(2):259 － 264．

Autophagic Cell Death Induced By Ganglioside

Ma Mingming1，Wang Xuejing2，Ding Xuebing3，Zhang Qianlin1，He Shuang1，Zhang Jiewen1
(1．Department of Neurology，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003，China;2．Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China;3．Department of Nephrology，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003，China)

Objective To investigate the effect of monosialotetrahexosy 1 ganglioside(GM1)on autophagic cell death in malignant glioma U251 cells treated with GM1．Methods The viability of cells was measured by MTT assay．The cell apoptosis was assayed by flow cytometry．Autophagic features were determined by fluorescence microscope．The autophagy-related protein expressions of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，Lamp-2a and Beclin-1 were assessed by Western blotting．Results After treatment of GM1 for 48 hours，the growth of U251 cells were significantly inhibited in dose-dependent manner(P ＜0．05);and GM1 increased autophagic cell death also in dose-dependent manner(P ＜0．05)．Compared with the control group，the levels of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，Lamp-2a and Beclin-1 were significantly increased in GM1 treatment groups(P ＜ 0．05)．Conclusion GM1 enhances autophagic cell death of malignant glioma U251 cells，which provides a novel strategy to treat drug-resistant malignant glioma．

autophagic cell death;monosialotetrahexosy 1 ganglioside;U251 cells

R730．264;R730．23

A

1673－5412(2012)04－0281－03

2012－02－02)

马明明(1976－)，男，博士，主治医师，主要从事脑血管病发病机制和遗传学研究。E-mail:macklon12@yahoo．com．cn

张杰文(1965－)，男，博士，主任医师，主要从事老年性痴呆和神经退行性疾病的研究。E-mail:zhangjiewen9900@126．com