广西甘蔗花叶病SCMV调查初报

颜梅新，黄伟华，邓展云，黄诚华，韦金菊

（广西壮族自治区甘蔗研究所/广西甘蔗遗传改良重点实验室，南宁 530007）

甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）引起的甘蔗花叶病是重要的甘蔗病害之一，在我国浙江[1]、福建[2]、广东[3]、广西[4]、云南[5]等地甘蔗产区普遍发生，为害严重。国内外对SCMV特性、分类地位、多样性等方面进行了研究，迄今，报道了200多个SCMV分离物CP基因序列，有的还进行全基因组序列测定[6-8]，许东林等2005年对华南地区引种基地侵染甘蔗的SCMV遗传多样性进行报道[3]。广西是SCMV的主要发生地区之一，但至今尚未对全区甘蔗品种品系间感SCMV进行调查，为此我们进行了相关研究。本文简要报道广西蔗区侵染甘蔗SCMV的初步调查结果。

1 材料与方法

1.1 样品采集与总RNA提取

从广西各主要蔗区采集不同品种（品系）显症的甘蔗样品，以茎尖组培脱毒的健康植株叶片作为阴性对照。采用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒抽提叶组织总RNA，具体步骤参考试剂盒说明书。

1.2 RT-PCR扩增

RT-PCR 扩增引物根据文献[9]合成，上游引物 SCMVF4 （5′-GTTTTYCACCAAGCTGGAACAGTC-3′；Y=C or T），下游引物 SCMVR3 （5′-AGCTGTGTGTCTCTCTGTATTCTC-3′），预期扩增产物约 700 bp。RT-PCR 用购自宝（大连）生物工程有限公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒进行，反应体系参照试剂盒说明，RT 体系：50μL 反应体系中总 RNA 约 0.08μg/μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL、2×1 Step Buffer 25 μL、引物 SCMVF4 和 SCMVR3（20 μM）各 1 μL ，用 DEPC ddH2O 补足 50 μL。 反应程序为：45℃30min；95℃ 2 min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min，35 个循环；72℃ 5min。 PCR 反应结束后， 扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，在UVP凝胶成像系统中观察检测结果。对部分RT-PCR产物直接送测序和BLAST比对，验证检测结果的正确性。

1.3 感病品种（品系）调查

2010年5—10月间先后从广西甘蔗研究所、驮卢、凭祥、柳州、柳城、鹿寨、百色、贵港等甘蔗主产区采集不同品种（品系）显症甘蔗样品进行SCMV RT-PCR分子检测。

2 结果

以各地显症病叶组织总RNA抽提液为模板，经引物对SCMVF4/SCMVR3进行一步法RT-PCR扩增。结果所检测36份样品中，其中25份显阳性（占69.4%），获得预期大小（约700 bp）的DNA电泳条带，健康和阴性对照样品均无任何扩增电泳（图1），另外11份未检出SCMV的显症样品均可检出SrMV（另文报道）。其中对8份扩增产物进行直接测序，结果有4份样品获得核苷酸数据，另外有4份测序不成功（产物浓度低，测序信号出现双峰或多峰）。所得序列在GenBank中比对，结果与巴西和中国云南等地的多个SCMV分离物有96%～100%同源性，确认它们均属SCMV基因片断序列。

图1 一步法RT-PCR检测甘蔗植株叶片样品中的SCMV

在所调查的品种（品系）中，目前广西主栽品种ROC22除在柳城蔗区未检测到SCMV（检测到SrMV，另文发表）外，其它蔗区均检测到，ROC22最易受SCMV侵染；其它台糖系列如台糖16、台糖28、台糖95-889、台优均检测到SCMV；柳城系列品种柳城03-182，柳城03-1137检测结果也呈阳性；广西甘蔗研究所许多品系也都受到SCMV的感染（见表1）。

表1 广西蔗区SCMV调查结果

3 讨论

本研究所调查的品种 （品系）中，目前主栽品种ROC22除在柳城蔗区未检测到SCMV（检测到SrMV，另文发表）外，在其他蔗区均检测到SCMV，说明ROC22最易受SCMV侵染。广西蔗区比较严重的问题是品种单一化，连年种植。据我们2010年调查，柳州地区甘蔗品种ROC22感花叶病比较严重，每一块蔗田平均30%显花叶症，有的甚至达100%。应该引起有关部门的重视，有效的防治方法是使用健康种苗或者替换品种，更换其它抗病品种。其它台糖系列如台糖16、台糖28、台糖95-889、台优均检测到SCMV；柳城系列品种柳城03-182、柳城03-1137也易感染SCMV；广西甘蔗研究所许多品系也检测到SCMV。了解这些情况，对于育种工作者来说尤为重要，为筛选亲本培育抗病品种提供参考。

许东林等对华南地区引种基地侵染甘蔗的SCMV遗传多样性进行研究，构建系统进化树发现，除广东分离物SCMV-W31和海南分离物SCMV-N8外，其它分离物高度相近，聚集成一个独立的簇[3]。我们广西的SCMV遗传多样性如何，是否与上述结果相类似，需要做进一步研究分析。

[1]蒋军喜，周雪平，洪健.杭州地区甘蔗花叶病病原鉴定[J].农业生物技术学报，2002，10（4）：377-380.

[2]姚伟，段真珍，周会，等.甘蔗花叶病毒福建分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析[J].植物病理学报，2006，36（4）：378-381.

[3]许东林，周国辉.侵染华南地区甘蔗的SCMV遗传多样性初探[J].植物病理学报，2005，35（6）：143-l44.

[4]秦碧霞，蔡健和，刘志明，等.侵染广西甘蔗的高粱花叶病毒分子鉴定初报[J].中国糖料，2007（4）：29-31.

[5]李文凤，董家红，丁铭，等.云南甘蔗花叶病病原检测及一个分离物的分子鉴定[J].植物病理学报，2007，37（3）：242-247.

[6]蒋军喜，谢艳，阙海勇.江西甘蔗花叶病病原的分子鉴定[J].植物病理学报，2009，39（2）：203-206.

[7]Grisham，M.P.，andPan，Y.-B.AgeneticshiftinthevirusstrainsthatcausemosaicinLouisianasugarcane[J].PlantDis，2007，91：453-458.

[8]Perera，M.F.，Filippone，M.P.，Ramallo，C.J.，Cuenya，M.I.，García，M.L.，Ploper，L.D.，and Castagnaro，A.P.Genetic diversity among viruses associated with sugarcane mosaic disease in Tucumán，Argentina[J].Phytopathology，2009，99：38-49.

[9]O.M.Alegria，M.Royer，M.Bousalem，M.Chatenet，M.Peterschmitt，J-C.Girard，and P.Rott.Genetic diversity in the coat protein coding region of eighty-six sugarcane mosaic virus isolates from eight countries，particularly from Cameroon andCongo[J].Arch Virol，2003，148：357-372.