广西宜州蔗区甘蔗宿根矮化病的调查及病原检测

李文凤，王晓燕，黄应昆，罗志明，尹 炯

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远 661600）

甘蔗宿根矮化病（ratoon stuning disease，RSD）是普遍存在于所有植蔗地区的一种世界性的重要病害，自1944—1945年在澳大利亚昆士兰首次发现以来，已有美国、南非、毛里求斯、印度、巴西等47个国家和地区报道了该病的发生，现已遍布世界各蔗区[1-7]。此病害由一种寄居木质部的较难培养的细菌——木质部赖氏菌木质部亚种 （Leifsonia xyli subsp.xyli，Lxx）引起[8]，主要通过带病蔗种和收获、砍种刀具等传播蔓延，且传播性极强，病蔗的蔗汁稀释至10000倍仍具有传染力。蔗株染病后变矮，蔗茎变细，生长迟滞，宿根发株少，在干旱地区和种植感病品种的蔗区所造成的损失尤其严重，病害造成损失的程度随宿根年限的增加而增加，一般减产10%～30%，干旱缺水时可达60%以上，还可导致品种退化。由于RSD无明显的外部和内部症状，病原菌难以分离、培养和检测，传统诊断方法极其困难，导致病害任意传播、扩展蔓延，对甘蔗生产危害极大。

甘蔗RSD属维管束病害，用一般的物理、化学方法难以消除，有效的防治方法是通过温水处理法生产脱毒种苗用于甘蔗生产，已在澳大利亚、美国、巴西、古巴、南非、菲律宾及我国台湾省等地应用多年[1]。而摸清蔗区RSD的分布、发生危害情况，是科学有效推广温水脱毒健康种苗的关键。本研究对广西宜州蔗区甘蔗宿根矮化病的发生和分布进行了调查和田间采样，通过实验室利用分子（PCR）和血清（I-ELISA）法等检测技术进行RSD检测，明确了宜州蔗区RSD发病状况，为宜州蔗区推广应用温水脱毒健康种苗、有效防控甘蔗宿根矮化病提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查与样品采集

于2009年甘蔗成熟期，对广西宜州太平、石别、思秧、六桥、廖歌、唐上、元江、同德、大岭、大安等甘蔗主产乡镇宿根矮化病的发生和分布进行了调查和田间采样。采样选择具有代表性的主栽或主推品种、旱地蔗，根据品种、植期分类，随机取样，共采集52个样本。每个样本取10条蔗茎，每条蔗茎截取中下部茎节，用砍刀切成7cm左右长，再用钳子挤压25mL左右的甘蔗汁于50mL离心管内充分混匀（每取一个样品后均用清水冲洗砍刀和钳子，再用70%的酒精消毒），放于4℃和-20℃冰箱保存待用。

1.2 I-ELISA检测

RSD抗血清和阳性对照由澳大利亚甘蔗试验总局 （BSES）提供，检测方法按参考文献［9］进行。

1.3 PCR检测

1.3.1 引物设计 引物序列采用已报道的RSD病原细菌Lxx 16S-23S rDNA基因间隔区特异引物[10]，预期扩增片段大小为 438 bp （上游引物 Lxxl：5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′； 下游引物 Lxx2：5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3′），委托上海生工生物技术有限公司合成。

1.3.2 蔗汁总DNA的提取 用改进的CTAB法提取蔗汁总DNA。每个样品取2mL蔗汁放入离心管中，12000r/min离心10min，弃上清液；沉淀加入300μL灭菌去离子水稀释混匀；加入600μL经65℃预热的2%CTAB 抽提缓冲液，65℃水浴 1h（期间每隔 20min 摇匀 1 次）；加入 600 μL 氯仿／异戊醇（24∶1）剧烈振荡 30s，12000r/min离心10min；取上清液700μL置于新的1.5mL离心管中，加入等体积氯仿／异戊醇（24∶1）温和地混匀，12000r/min离心10min；取上清液650μL置于新的1.5mL离心管中，加入2／3体积（455μL）的异丙醇，混匀后置-20℃冰箱中沉淀4h或过夜；4℃下12000r/min离心10min；弃上清液，沉淀分别用400μL预冷的70%乙醇和冷无水乙醇各洗1次；室温下风干，溶于30μL双蒸水中（用手指轻弹离心管使沉淀充分悬浮），-20℃保存。

1.3.3 PCR扩增和结果判别 以抽提的蔗汁总DNA为模版，采用天根生化科技 （北京）有限公司的Taq PCR MasterMix进行 PCR 扩增。 扩增体系 20μL：ddH2O 8.6μL，2×PCR Taq mix 8μL，DNA 模板 3μL，上下游引物各 0.2μL（20μg/μL）；扩增程序为：95℃预变性 5min，94℃变性 30s，56℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 个循环后72℃延伸5min。PCR扩增结果判别：取10μL PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增到438bp条带的为阳性，未扩出438bp条带的为阴性；根据目的片段条带亮度的强弱进一步判别样品带菌浓度的相对高低，条带较亮的样品为强阳性、一般的为中阳性，较弱的为弱阳性。

2 结果与分析

2.1 各主产乡镇RSD发生情况

对广西宜州太平、石别、思秧、六桥、廖歌、唐上、元江、同德、大岭、大安10个甘蔗主产乡镇宿根矮化病的调查和检测结果表明，宜州蔗区RSD发生普遍。采用PCR和I-ELISA法对采集的52个样本进行RSD检测，结果一致。52个样品中37个呈阳性，阳性检出率为71.15%；其中强阳性样品15个，占28.85%；10个甘蔗主产乡镇均检测出RSD，阳性检出率在20.00%～100%之间，检出率最高的是元江和大安，高达100%，其次是大岭，检出率为85.71%（表1）。

表1 广西宜州主产乡镇RSD发生情况

2.2 不同品种、植期RSD发生情况

从检测结果看，田间主栽或主推品种中桂糖94-119、台优、ROC16、ROC20、园林1号、赣蔗18号、桂引9号等多个品种均发病，其中尤以桂糖94-119发病最重、其次是ROC16、台优、ROC20等主栽品种发病严重；植期上1、2、3年均不同程度发病，但三者之间无明显差异（表2）。

表2 广西宜州甘蔗宿根矮化病(RSD)检测结果

3 结论与讨论

3.1 田间随机取样检测结果表明，广西宜州蔗区太平、石别、思秧、六桥、廖歌、唐上、元江、同德、大岭、大安主产乡镇均检测出RSD，检测的52个样品中，有37个样品为阳性带菌、占71.15%，其中有15个样品为强阳性带菌量高、占28.85%，由此可见，RSD在宜州蔗区发生普遍；田间主栽或主推品种中桂糖94-119、台优、ROC16、ROC20、园林1号、赣蔗18号、桂引9号等多个品种均发病，其中尤以桂糖94-119发病最重，其次是ROC16、台优、ROC20等主栽品种发病严重；植期上1、2、3年均不同程度发病，但三者之间无明显差异。根据甘蔗宿根矮化病检测结果，结合我们的多年试验结果以及国外的研究和生产应用效果，在宜州蔗区生产推广应用甘蔗脱毒种苗将会获得显著的增产效果：平均单产可比传统种植提高1.0t/667m2左右，增幅15%～30%，可有效地防治甘蔗病害，特别是RSD的传播，是提高甘蔗产量，延长甘蔗宿根年限最具潜力和效能的重要措施。为此，在宜州蔗区认真组织做好甘蔗温水脱毒种苗生产、繁殖、示范工作，建立甘蔗脱毒种苗生产与应用推广技术体系及相应技术规程，在生产上加快推广，使之制度化，可大幅度提高甘蔗的产量、延长宿根蔗年限，从而显著提高甘蔗生产的经济效益，以此解决甘蔗生产特别是宿根甘蔗长期以来低产、宿根年限短、生产成本高，效益差的问题。

3.2 科学布局温水脱毒种苗示范基地。选择与糖厂相邻近，交通便利、排灌方便，地势平坦，地块土质、肥力均较好的良繁基地30～70hm2作为甘蔗脱毒种苗示范基地一级种苗圃（明确专业技术人员负责，由管理水平较高的专业种苗大户种植管理，提供一级脱毒种苗）；分别在各甘蔗主产乡镇规划建立甘蔗脱毒种苗基地二、三级种苗圃300～700hm2（由专业种苗户种植管理，专用于繁殖一级种苗圃提供的一级脱毒种苗），由二、三级专用种苗圃直接为大面积生产提供无病种苗。

[1]J.P.马丁，E.V.阿伯特，C.G.休慈（陈庆龙译）.世界甘蔗病害（第 1 卷）[M].北京：农业出版社，1982：299-319.

[2]Bailey R A，Tough S A.The current disribution of ratoon stunting disease in the South African sugar industry[C].Procedure65thAnnual Congress South African Sugar Technology Associate，1991：25-29.

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[9]李文凤，黄应昆，卢文洁，等.甘蔗宿根矮化病的I-ELISA快速检测.中国糖料，2008（1）：33-34.

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