曲霉菌细胞工厂的现状及前景

顾丰颖，高 洁，何国庆

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310058)

曲霉菌(Aspergilli)是一类最为常见的真核微生物，被应用于传统的食品发酵中也具有悠久的历史。近年来，随着生物技术的发展，曲霉菌在食品工业，饲料业，制药业等方面均显示出重要的应用价值。与细菌及酵母等相比，曲霉具有强大的降解酶系及完善的蛋白分泌途径，使其具有可快速生长繁殖，适应恶劣环境，在低值培养基及低pH环境中仍能保持较高的生物代谢活性等特性。此外曲霉菌具有高效分泌系统［1-2］，可将酶或其他多肽高效分泌出体外，有利于重组蛋白的分离纯化。由于其可更好的适应工业发酵，曲霉菌逐步被开发为良好的工业生产宿主菌即微生物细胞工厂。目前已被分类并已命名曲霉属约有250种［3］，其中包括黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、泡盛曲霉(A.awamori)、酱油曲霉(A.sojae)、土曲霉(A.terreus)等许多重要的工业菌种。近年来通过生物技术的介入，曲霉菌已被开发成为多种有机酸(柠檬酸、没食子酸、葡糖酸等)以及工业酶、蛋白制剂(纤维素酶、淀粉酶、果胶酶等)的主要工业生产菌［4］。

1 曲霉菌基因及基因组

1.1 策略及工具

近十年来随着对真菌曲霉研究的深入，更多的新方法及技术被应用在对曲霉菌的基因研究中，这些研究主要围绕在以下几个方面［5］。第一是建立有效的遗传转化体系。缺乏有效的遗传转化系统一度成为曲霉菌株工业化基因操作最大的障碍，这不仅限制了选择性标记的有效性，还降低了基因打靶效率(通常约1%～5%)。近年来，以原生质体介导的多种曲霉(包括黑曲霉，米曲霉，土曲霉，酱油曲霉等)的遗传转化系统得以建立［6］;泡盛曲霉的遗传转化系统也通过土壤杆菌介导转化得到有效的解决［7］。此外，已开发的自主复制载体融合了多种选择性标记系统(如抗生素抗性标记:hph、ble、oliC3;营养缺陷型标记:pyrG、pyrE、argB、adeA、adeB、niaD、trpC、sC;营养标记amdS、ptrA等)，这为曲霉菌株的工业化基因操控提供了更大的可能性［8-10］。曲霉菌分子研究的大跃进基于真菌模式菌株粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的开发，对其研究中发现当受体菌株缺乏非同源末端连接(non-homologous end joining)时，同源重组率可增加到100%。这已在黑曲霉、米曲霉等多个曲霉菌种得到证实。

其次是建立高水平可控的蛋白生产的表达系统。目前应用曲霉菌生产重组蛋白的表达系统已有多个成功案例，二十多种曲霉启动子被应用于高水平的同源或异源蛋白的生产中［9］。这些启动子一般是通过结构活性(葡糖淀粉酶启动子PglaA等)或培养基碳源的诱导作用(乙醇脱氢酶启动子 PalcA、α-淀粉酶启动子PamyA等)而产生效应的。此外建立高通量基因定向工具，以及建立细胞生物技术研究的影像播放技术也是曲霉菌基因研究的主要方向。

1.2 曲霉菌的基因组学

1998年，Cereon公司对构巢曲霉(A.nidulans FGSC A4)的基因组进行测序从而开启了曲霉菌基因组测序的先河，该全基因组采用鸟枪法测序，3倍覆盖率，然而该序列的信息在近年来才被公开。随后，构巢曲霉的全基因组进一步采用了13倍覆盖率进行测序，并在2003年被Whitehead机构/MIT基因组研究中心(也就是现在的Broad机构)公开，其全基因大小约30.1M碱基对，包含了8个染色体组［11］。随后，真菌特别是曲霉菌的基因组得到快速的发展(表1)，例如韦尔科姆基金会桑格研究院(Wellcome Trust Sanger institute)以及基因组研究学会(TIGR)共同进行的烟曲霉(A.fumigatus Af293)基因组测序，采用全基因组随机测序方法结合光学标测法(optical mapping)获得包括8个染色体组的29.4M碱基对的序列数据［12］。而三株不同的黑曲霉工业菌株的基因组也先后被三家机构测序(即荷兰的帝斯曼公司DSM、美国Integrated Genomics公司及美国能源部基因组学研究所JGI)。2001年底DSM首先采用BAC和鸟枪法完成了黑曲霉CBS 513.88的测序，大小33.9Mb，8倍覆盖率14000多个基因，但该数据一直到2007年前一直为其公司内部使用［13］。随后，黑曲霉ATCC 9029菌株被Integrated Genomics公司测序，大小约32Mb，4倍覆盖率，约10000个重叠群。与此同时在美国能源部的支持下JGI完成了黑曲霉ATCC 1015菌株的基因组测序，获得约34.9Mb的序列信息，8.9倍覆盖率并于2006年公开发表［14］。此外，对米曲霉(A.oryzae)的测序由日本的工业科学技术进展国际学会(AIST)进行。米曲霉RIB40的全基因组于2005年公开发表，基因组大小约37.2Mb，9倍覆盖率，包括8个染色体组［15］。到目前，曲霉菌的基因组测序已完成了十余个，表2为已公开发表的曲霉基因组序列的公共网址。

表1 曲霉菌基因组的简要信息Table 1 Summary of information on Aspergillus genomes

曲霉基因组数据的公开，使建立在基因组基础上的转录组，蛋白质组及代谢组等方面的研究得到快速的发展。所获得的大量基础数据为建立曲霉菌细胞工厂奠定了基础，也为工业生产菌株的性能改造提供了更多的思路以及更大的可能性。

2 后基因组时代曲霉菌组学技术的发展

真菌基因组测序的大规模完成使曲霉菌的研究进入了系统生物学的时代。为挖掘探讨并更好地利用所获得的大量数据，一些新技术新方法也应运而生，从而产生了真菌生物学研究的一个全新技术——组学技术(Omics)。对全基因、全蛋白以及代谢调控网络整体的研究取代了过去对单个基因单个蛋白的研究，这使对曲霉工业菌株在生产性能，稳定性能及可行性上的分析更为深刻。组学技术可分支为转录组学、蛋白质组学、代谢组学、反应组学及表达组学等，这些全新的技术及方法为构建曲霉菌细胞工厂提供新的思路，并使其得以实现。

2.1 转录组学(Transcripomics)

利用DNA芯片对比分析细胞mRNA，一般分为以已知的DNA序列为基础的寡核苷酸阵列、cDNA微阵列及EST分析等技术;或对未知序列信息进行分析的基因表达系列分析(SAGE)、差异消减杂交(SSH)等技术。近年来，对曲霉菌转录组的研究也取得了一定进展。Guillemette、Levin及Jacobs等人提供了一种整合转录组及蛋白质组的方法，从而改善了黑曲霉的蛋白分泌能力［16-18］。Anderson通过基因芯片对黑曲霉、米曲霉及构巢曲霉的比较转录组分析结果鉴定得到了曲霉菌中的23个保守基因及365个差异表达蛋白［19］。而DNA微阵列技术也被应用于对米曲霉的比较转录组分析中［20］，这种技术可以有效的对曲霉菌的代谢产物进行鉴别，为工业新蛋白的开发利用提供了新的工具。

2.2 蛋白质组学(Proteomics)

有关曲霉菌蛋白质组学方面的研究，在近5年逐渐引起人们的关注，新增了大量基础研究数据。大量序列被分析并公布其结果，蛋白质组学的研究技术得到快速的发展。微生物的蛋白质组学研究目前主要有3种策略:一是表达蛋白质组学，二是比较蛋白质组学，三是免疫蛋白质组学。建立在二维聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱的基础上涌现了大量的新技术，为准确而大规模获取蛋白质组有效数据提供了有效的手段。其中包括蛋白质标准绝对定量技术(protein standard absolute quantification，PSAQ);多连体定量标准技术(quantitative concatenated standard，QconCAT);蛋白丰度的绝对定量(absolute quantification of abundance，AQUA);细胞培养的氨基酸稳定同尾数标记技术(stable isotope labelling by amino acids in cell culture，SILAC);同位素亲和标签技术(isotope-coded affinity tags，ICAT);等量标记的相对和绝对定量技术(isobaric tag for absolute and relative quantificationi，TRAQ);串联质谱标签(tandemmass tags，TMT);同位素蛋白标记技术(isotopecoded protein labelling，ICPL)等。技术的发展也使曲霉菌的蛋白质组学研究取得了突飞猛进的成果，Teutschbein 等［21］对烟曲霉(Aspergillus fumigatus)分生孢子的蛋白质组学分析，推测分生孢子的复杂蛋白质组成与其应激抗性以及快速萌发有着密切关系。对萌发的烟曲霉分生孢子的研究显示:CipC-like蛋白是一种菌丝特异性蛋白，这种胞内蛋白的生物学功能尚不明确，推测其可能与侵袭性生长相关。2005 年，Schwienbacher［22］对烟曲霉的主要分泌蛋白进行分析，鉴定确定其分泌组中包含多种代谢相关酶，如核糖核酸酶(与抑制真核蛋白合成相关)、脱乙酰几丁质酶chiB及β-1，3内切葡聚糖酶两种细胞壁多聚物降解酶。Adav等应用iTRAQ技术［23］对不同pH下的黑曲霉分泌蛋白质组的分析表明:黑曲霉的蛋白质组组成可通过调节pH发生显著的变化，即一些特定酶的生产可通过调节培养基的pH完成。除了对胞内蛋白质组，分泌蛋白质组的研究外，对曲霉的亚蛋白质组，细胞壁及膜蛋白的蛋白质组的研究也逐渐成为又一个新的热点。

表2 曲霉菌的公共基因组网址Table 2 Public genome websites for different Aspergillus species

2.3 代谢组学(Metabolomics)

继基因组学及蛋白质组学之后，基于高通量定量分析生物体内所用代谢物的思路，代谢组学得以发展起来。其主要技术手段包括核磁共振(NMR)，质谱(MS)，色谱(HPLC，GC)以及气质联用(GCMS)，液质联用(LC-MS)和气相色谱-飞行时间质谱仪(GC-TOF)等。由于代谢物的浓度是直接与代谢途径相关的，因此对曲霉菌代谢组的分析可以有效的指导我们应该对菌株的哪些代谢途径进行改造，为合理构建并优化曲霉菌细胞工厂奠定基础。Kouskoumvekaki［24］等对重组曲霉菌代谢组学研究，在对450种重组菌代谢物的鉴定分析中发现，其中7种代谢物可以作为生物标记用于菌株的基因型鉴定。2008年，基于基因组数据库及扩展数据，Andersen［25］等和 Vongsangnak［26］等分别建立了黑曲霉及米曲霉的代谢网络。而Microbia公司结合了转录组学及代谢组学的分析，对土曲霉调控基因进行改造，使其洛伐他汀(lovastatin)的生产力提高了50%，为工业生产力的提高提供了更大的创造空间［27］。

3 新构思及展望

3.1 后基因组时代的新产品

由于曲霉菌被做为食品工业、医药工业、酶制剂工业等多方面领域的细胞工厂的地位得以肯定，在曲霉菌基因组的研究已获得了大量数据的基础上，对曲霉菌新一轮的基因组挖掘(genome mining)正如火如荼的进行着。事实上，对基因组的分析结果已揭示了比预期更多的次级代谢生物合成过程。典型的曲霉菌基因一般存在30～40个基因簇，为系统挖掘这些基因簇的功能并绘制图谱，已在互联网上开放了一些生物信息工具。网络工具SMURF(Secondary Metabolite Unknown RegionsFinder;www.jcvi.org/smurf/)就是其中之一。然而，大多数的次级代谢物基因簇由于基因沉默等原因，不能在实验室或工业生产的条件下得到表达。为激活并表达这些沉默的基因簇，学者们采用了多种技术手段，并使其能有效的在工业生产中应用。其中不乏一些行之有效的案列，Bergmann等［28］于2007年通过操控激活一个转录因子的特定通路，激活了模式菌株(构巢曲霉)的一条沉默代谢通路，使得两种全新的次级代谢产物得以鉴定。而Bok［29］通过定向操纵染色质状态，去除一个染色质中的沉默基因，使至少两个基因簇被激活表达。2010年，Jorgensen等［30］控制黑曲霉的生长条件，使其处于接近零生长率的状态，从而诱导黑曲霉的特殊次级代谢物基因簇发生表达。因此综合多种技术手段使曲霉菌潜在次级代谢物的开发具有更大的可能性。

越来越多的报道表明，曲霉菌的代谢产物具有极大的商业潜力:其中多不饱和脂肪酸可作为食品添加剂或是燃料原料;聚酮化合物及非核糖体肽具有潜在的药物治疗作用;类异戊二烯被认为是一种全新的健康食品;脂肽以及AFP源蛋白可作为抗真菌剂等等。随着基因工程技术的成熟并不断更新，为曲霉菌的开发开辟更多新的途径，未来也将使更多非真菌源的化合物可被曲霉菌表达生产，在不远的未来曲霉菌定将成为多目标表达的平台。

3.2 展望

为充分探索和利用曲霉菌使其成为一个多目标表达平台，学者们不断提出更多的新概念新构想。如在新的生产菌种开发中应尽可能的全部去除非目的次级代谢物基因簇，并以此作为工业生产分级的标准，即在对产品质量水平要求不同的工业领域(如燃料原料、饲料、食品、酶制剂、医药等)时，应对应不同要求开发不同的菌株。应根据曲霉的密码偏好型筛选曲霉菌或非真菌源的基因或基因簇，并在基因座中插入表达构建体(expression constructs)，以使曲霉菌的基因表达得到最有效的操控。

此外，细胞器工程的发展也为曲霉菌细胞工厂的开发提供了一个新的构思。胞内蛋白可以通过peroxicretion途径［31］进行分泌(一种新的真核细胞的分泌途径，该途径通过在过氧化物酶体上人工装饰高尔基体源的V-SNARE，使过氧化物酶体与细胞膜融合，再利用过氧化物酶的分泌囊泡将胞内蛋白质释放到胞外)。

将曲霉菌生物技术、系统生物学工具以及代谢工程成功相互融合的关键，不仅要标准化控制曲霉菌培养生产的过程，更要通过生物信息学方法将获得的转录组、蛋白质组代谢组等大量组学数据合理有效的分析得到正确推论。建立以基因组为基础的代谢模型并对代谢流合理分析是鉴定限制性通路并预测有益代谢工程的关键。而对曲霉菌的细胞生物学研究(诸如细胞的体内影像监控研究in vivo live imaging)对全面地了解曲霉菌的细胞内工作过程也是必不可少的。这些新思路的提出必将促使曲霉菌细胞工厂的开发应用走上一个崭新的阶段。

［1］Cherry J R，Fidantsef A L.Directed evolution of industrial enzymes:an update［J］.Curr Opin Biotechnol，2003，14(4):438-443.

［2］Ward O P，Qin W M，Hanjoon J，et al.Physiology and biotechnology of Aspergillus［J］.Adv Appl Microbiol，2006，58(1):1-75.

［3］Geiser D M，Klich M A，Frisvad J C，et al.The current status of species recognition and identification in Aspergillus［J］.Stud Mycol，2007，59:1-10.

［4］Lubertozzi D，Keasling J D.Developing Aspergillus as a host for heterologous expression［J］.Biotechnol Adv，2009，27:53-75.

［5］Meyer V，Wu B，Ram A F J.Aspergillus as a multi-purpose cell factory:current status and perspectives［J］.Biotechnol Lett，2011，33:469-476.

［6］Meyer V.Genetic engineering of filamentous fungi-progress，obstacles and future trends［J］.Biotechnol Adv，2008，26:177-185.

［7］Michielse C B，Hooykaas P J，van den Hondel C A，et al.Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi［J］.Curr Genet，2005，48:1-17.

［8］Carvalho N D，Arentshorst M，Jin Kwon M，et al.Expanding the ku70 toolbox for filamentous fungi:establishmentof complementation vectors and recipient strains for advanced gene analyses［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，87:1463-1473.

［9］Fleissner A，Dersch P.Expression and export:recombinant protein production systems for Aspergillus［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，87:1255-1270.

［10］MeyerV，Ram A F，PuntP J.Genetics，genetic manipulation，and approaches to strain improvement of filamentous fungi.In:Demain AL，Davis J(eds)Manual of industrial microbiology and biotechnology［M］.Wiley，New York，2010:318-329.

［11］Galagan J，Calvo S，Cuomo C，et al.Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with A.fumigatus and A.oryzae［J］.Nature，2005，438:1105-1115.

［12］Nierman W，Pain A，Anderson M，et al.Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus［J］.Nature，2005，438:1151-1156.

［13］Pel H，de Winde J，Archer D，et al.Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88［J］.Nature Biotechnology，2007，25(2):221-231.

［14］S.Baker.Aspergillus niger genomics:past，present and into the future［J］.Med Mycol，2006，44(S1):S17-S21.

［15］Machida M，Asai K，Sano M，et al.Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae［J］.Nature，2005，438:1157-1161.

［16］Guillemette T，van Peij N N，Goosen T，et al.Genomic analysis of the secretion stress response in the enzyme-producing cell factory Aspergillus niger［J］.BMC Genomics ，2007(8):158.

［17］Levin A M，de Vries R P，Conesa A，et al.Spatial differentiation in the vegetative mycelium of Aspergillus niger［J］.Eukaryot Cell，2007(6):2311-2322.

［18］Jorgensen T R，Goosen T，Hondel C A，et al.Transcriptomic comparison of Aspergillus niger growing on two different sugars reveals coordinated regulation of the secretory pathway［J］.BMC Genomics，2009(10):44.

［19］Andersen M R，Nielsen M L，Nielsen J，et al.Metabolic model integration of the bibliome，genome，metabolome and reactome of Aspergillus niger［J］.Mol Syst Biol，2008(4):178.

［20］Abe K，Gomi K，Hasegawa F，et al.Impact of Aspergillus oryzae genomics on industrial production of metabolites［J］.Mycopathologia，2006，162(3):143-153.

［21］Teutschbein J，Albrecht D，Pötsch M，et al.Proteome profiling and functional classification of intracellular proteins from conidia of the human-pathogenic mold Aspergillus fumigatus［J］.J Proteome Res，2010(9):3427-3442.

［22］Schwienbacher M，Weig M，Thies S，et al.Analysis of the major proteins secreted by the human opportunistic pathogen Aspergillus fumigatus under in vitro conditions［J］.Med Mycol，2005，43:623-630.

［23］Adav S S，Li A A，Arulmani M，et al.Quantitative iTRAQ secretome analysis of Aspergillus niger reveals novel hydrolytic enzymes［J］.J Proteome Research，2010(9):3932-3940.

［24］Kouskoumvekaki I，Yang Z Y，Jónsdóttir S ó，et al.Identification of biomarkers for genotyping Aspergilli using nonlinear methodsforclustering and classification［J］.BMC Bioinformatics，2008(9):59.

［25］Andersen M R，Nielsen M L，Nielsen J.Metabolic model integration of the bibliome，genome，metabolome and reactome of Aspergillus niger［J］.Mol Syst Biol，2008(4):178.

［26］Vongsangnak W，Olsen P，Hansen K，et al.Improved annotation through genome-scale metabolic modeling of Aspergillus oryzae［J］.BMC Genomics，2008(9):245.

［27］Askenazi M，Driggers E M，Holtzman D A，et al.Integrating transcriptional and metabolite profiles to direct the engineering of lovastatin-producing fungal strains［J］.Nat Biotechnol，2003，21:150-156.

［28］Bergmann S，Schumann J，Scherlach K，et al.Genomicsdriven discovery of PKS-NRPS hybrid metabolites from Aspergillus nidulans［J］.Nat Chem Biol，2007(3):213-217.

［29］Bok J W，Chiang Y M，Szewczyk E，et al.Chromatin-level regulation of biosynthetic gene clusters［J］.Nat Chem Biol，2009(5):462-464.

［30］Jorgensen T R，Nitsche B M，Lamers G E，et al.Transcriptomic insights into the physiology of Aspergillus niger approaching a specific growth rate of zero［J］.Appl Environ Microbiol，2010，76:5344-5355.

［31］Sagt C M，ten Haaft P J，Minneboo I M，et al.Peroxicretion:a novel secretion pathway in the eukaryotic cell［J］.BMC Biotechnol，2009(9):48.