不同厂家银杏达莫注射液中萜类内酯测定

金英华， 何正有， 王艳峰， 安 静， 姚 洁， 李 维， 邹 昆

(中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所，四川成都610052)

银杏达莫注射液是由银杏叶提取物及双嘧达莫制备而成的复方制剂。该制剂具有改善心脑血管循环、减少血栓及动脉硬化、降低血液黏度等作用，临床上主要用于预防和治疗冠心病、血栓栓塞性疾病［1-2］。银杏达莫注射剂的现行标准仅规定了黄酮苷和双嘧达莫的含有量［2］，对萜类内酯没有要求。鉴于萜类内酯是银杏叶相关制剂的重要有效成分，对免疫系统、中枢神经系统、缺血性损伤有保护作用［3-4］，因此有必要对银杏达莫注射液中的萜类内酯进行定量测定。银杏达莫注射液主要生产企业有:贵州益佰制药股份有限公司、博安兄弟制药有限公司、湖北民康制药有限公司、山西普德药业股份有限公司等。本试验选择了3个厂家生产的9批样品，采用HPLC-ELSD法测定萜类内酯。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent高效液相色谱仪(型号Agilent 1200)、Altech蒸发光散射检测器(型号 Altech 2000ES)。

1.2 对照品、试剂和供试药品 白果内酯(批号100865-200605)、银 杏 内 酯 A(批 号 100862-200608)、银杏内酯B(批号100863-200508)、银杏内酯C(批号100864-200906)，均购于中国药品生物制品检定所。乙腈(色谱纯)、异丙醇(色谱纯)、水(去离子水)。供试药品:贵州益佰制药股份有限公司，产品批号:20101208、20100309、20100501，规格:5 mL/支;博安兄弟制药有限公司，产品批号:20100301、20100403、20101102，规格:10 mL/支;湖北民康制药有限公司，产品批号:101029、100923、101020。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Welch C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-异丙醇-水(9 ∶7.5 ∶83.5);体积流量1.0 mL/min;漂移管温度105℃，载气体积流量3.0 L/min。理论板数按白果内酯计算不低于3 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品制备 取银杏内酯A、B、C和白果内酯，精密称量，加甲醇制成每1 mL含银杏内酯A 0.5 mg，银杏内酯B、C和白果内酯各0.2 mg的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品制备 精密吸取注射液30 mL，用2%盐酸调节pH至2，用乙酸乙酯萃取4次(30、20、20、20 mL)，合并乙酸乙酯，用5%乙酸钠溶液20 mL洗涤，分取乙酸钠溶液，用10 mL乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯，以20 mL水洗涤，有机相浓缩至干，残渣加甲醇转移至2 mL量瓶中，并以甲醇定容至刻度，摇匀、滤过，即得。

2.2.3 阴性样品供试液制备 按处方配制不添加银杏提取物的阴性样品，精密吸取30 mL，照2.3项下供试品制备方法同法制备，即得。

2.3 系统适用性试验 精密量取混合对照品、供试品溶液和阴性样品供试液注入液相色谱仪进行分析并记录色谱图。以白果内酯峰计算其理论板数为22 708;白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C 4成分间分离度均大于1.5;阴性样品供试液谱图中在上述组分的峰位处均无干扰峰出现。结果表明4种成分可同时进行定量分析。

图1 混合对照品(A)、样品(B)和阴性对照品(C)色图谱Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substance(A)，sample(B)and negative sample(C)

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取对照品4、6、8、10、15 μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件进样测定并记录色谱图。按照外标两点法对数方程，分别以白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品的质量的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明银杏内酯A在1.98 ～7.44 μg、银杏内酯 B 在 0.84 ～3.15 μg、银杏内酯C在0.82～3.07 μg、白果内酯在0.80～3.00 μg范围内线性关系良好，回归方程为:银杏内酯 A:Y=1.086 8X+5.844 2，r=0.999 3;银杏内酯B:Y=0.957 9X+5.347 9，r=0.999 3;银杏内酯 C:Y=0.939 1X+5.335 5，r=0.999 1;白果内酯:Y=1.096 1X+5.863 8，r= 0. 999 6。

2.4.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，连续进样6次，银杏内酯A、B、C和白果内酯峰面积的 RSD值分别为0.79%、0.84%、0.77%、0.51%，表明本法精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取上述供试品溶液室温放置，分别于0、2、4、6、8、24 h 精密吸取 10 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，银杏内酯A、B、C和白果内酯峰面积的 RSD分别为 1.37%、1.44%、1.32%、1.11%，表明本供试品溶液室温24 h内基本稳定。

2.4.4 重复性试验 取样品，按2.2.2项下分别制备6份供试液，在上述色谱条件下测定，记录色谱图，按外标两点对数法计算供试品中白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含有量。测得其含有量的RSD 值分别为1. 07%、1. 06%、1. 50%、1.11%，表明方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 取银杏达莫注射液(贵州益佰制药有限公司，含有量已知)15 mL，共6份，两份精密加入混合对照品溶液1 mL(含银杏内酯A 0.80 mg，银杏内酯B 0.25 mg，银杏内酯C 0.51 mg，白果内酯0.26 mg);两份精密加入混合对照品1 mL(含银杏内酯A 1.05 mg，银杏内酯B 0.29 mg，银杏内酯C 0.62 mg，白果内酯0.31 mg);两份精密加入混合对照品1 mL(含银杏内酯A 1.20 mg，银杏内酯B 0.35 mg，银杏内酯 C 0.75 mg，白果内酯0.39 mg)。按2.2.2项下分别制备6份供试液，测定，计算，求得白果内酯和银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的平均回收率和RSD值，结果见表1。

表1 加样回收率试验Tab.1 Results of recovery tests

2.5 样品测定结果 取银杏达莫注射液样品，每个批号的样品按2.2.2项下分别制备3份供试液，在上述色谱条件下测定，记录色谱图，按外标两点对数法计算供试品中白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的质量浓度。9批银杏达莫注射液样品测定结果见表2。

3 讨论

3.1 目前对银杏叶制剂中银杏萜类内酯的测定有较多报道，涉及的剂型包括片剂［5-7］、滴丸剂［8］、注射剂［9-12］等。多数文献报道的测定方法使用甲醇-四氢呋喃-水体系或乙腈-四氢呋喃-水体系为流动相。采用甲醇-异丙醇-水体系，以异丙醇代替四氢呋喃，降低了流动相对人体的毒性和试验成本。

3.2 试验结果表明，3个厂家生产的银杏达莫注射液均含有萜类内酯，但质量浓度略有差异，贵州益佰制药股份有限公司和博安兄弟制药有限公司的产品萜类内酯质量浓度均在0.60～0.80 mg/mL范围内，且不同批次间差异较小，湖北民康制药有限公司的产品不同批次间萜类内酯质量浓度差异稍大。

3.3 萜类内酯是银杏叶提取物重要的有效成分之一，本试验选取的3个厂家生产的9批样品中全部含有萜类内酯，表明现行标准仅规定黄酮苷含有量和双嘧达莫含有量无法全面反应药品的质量，建议增加对萜类内酯含有量的规定，更全面的反应药品质量。

表2 银杏达莫注射液内酯测定结果Tab.2 Results of content determination in injection samples

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