HPLC法同时测定生脉饮中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素

倪 琳， 杨 锡

(甘肃省食品药品检验所，甘肃省中药品质与安全评价工程技术研究中心，甘肃兰州730000)

生脉饮收载于《中国药典》2010年版一部，由红参、麦冬、五味子组成，具有益气复脉，养阴生津。用于气阴两亏，心悸气短，脉微自汗［1］。原标准有红参、麦冬的薄层色谱鉴别，无定量测定项。方中五味子的主要有效成分为五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素。本实验采用高效液相色谱法同时测定五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素，方法简便，结果准确可靠，可有效控制产品质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters Alliance e2695四元泵，Waters 2998二级管阵列检测器;Mettler AE240电子天平。

1.2 试药 五味子醇甲对照品(批号:110857-200709)、五味子甲素对照品(批号:0764-200107)、五味子乙素对照品(批号:110765-200205)，均购自中国药品生物制品检定所;生脉饮样品由甘肃普安制药有限公司提供;甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲0.021 72 mg、五味子甲素0.018 54 mg、五味子乙素0.021 72 mg的混合溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备 精密吸取本品10 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 阴性对照溶液的制备 按供试品的处方和制法，制成不含五味子的阴性样品，按上述供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。

2.4 色谱条件及系统适应性试验 色谱柱选用CAPCELL PAK C18柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm);流动相为梯度洗脱:Ⅰ.甲醇-水(65∶35)(0～12 min):Ⅱ.甲醇-水(75 ∶25)(12 ～45 min);Ⅲ.甲醇-水(65∶35)(45～50 min);检测波长为220 nm;体积流量为1.0 mL/min;进样体积20 μL;柱温为30℃。理论板数按五味子醇甲计算应不低于5 000。对照品，供试品以及阴性对照色谱图见图1。阴性对照无干扰。

图1 混合对照品(A)、生脉饮样品(B)和阴性对照样品(C)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)，Shengmai Oral Liquid sample(B)and negative sample(C)

2.5 工作曲线与线性关系 分别精密吸取混合对照品溶液 8、10、15、20、25、30 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值，以峰面积积分值为横坐标(X)，对照品溶液的进样量(μg)为纵坐标(Y)，分别得到回归方程:

五味子醇甲Y=1.768 4×10-7X-2.451 9×10-3，r=0.999 8。

五味子甲素Y=1.641 8×10-7X-5.722 0×10-3，r=0.999 9。

五味子乙素Y=1.625 6×10-7X-7.874 5×10-4，r=0.999 8。

结果表明，五味子醇甲在0.173 8 μg～0.651 6 μg、五味子甲素 0.148 3 μg ～0.556 2 μg、五味子乙素0.173 8 μg～0.651 6 μg范围内均呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定峰面积，五味子醇甲RSD为0.67%、五味子甲素RSD为1.16%、五味子乙素RSD为1.27%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，每隔2 h进样1次，结果在10 h内供试品溶液中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素峰面积稳定，RSD分别为1.21% 、1.23% 、1.05% 。

2.8 重复性试验 取生脉饮样品6份，每份精密吸取10 mL，按供试品溶液制备方法制备，在确定的色谱条件下进行分析，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素RSD分别为0.87%、1.11%、1.35%。

2.9 加样回收率试验 取已测定五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的供试品(批号:20100502)6份，每份精密吸取5 mL，置50 mL量瓶中，分别精密加入一定量的五味子醇甲对照品(0.140 2 mg/L)、五味子甲素对照品(0.055 mg/L)、五味子乙素对照品(0.057 mg/L)对照品溶液，按供试品溶液制备方法制备，依法测定，即得。见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

2.10 样品的测定 取3批生脉饮按供试品溶液的制备方法制成供试液，分别进样，测得峰面积值，计算生脉饮中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的质量浓度。见表2。

表2 样品测定结果(n=3)Tab.2 Results of sample determination(n=3)

3 讨论

3.1 样品提取方法的选择 曾试验:①加甲醇提取样品，测得总量为0.201 mg/mL;②加甲醇超声提取样品，测得总量为0.202 mg/mL;③加三氯甲烷萃取样品，测得总量为0.086 mg/mL;④加乙酸乙酯超声提取样品［2］，测得总量为0.196 mg/mL。结果表明，4种提取方法其中方法①和方法②质量浓度较方法③、④高，且方法①提取方法较简便，所以选择方法①作为样品提取方法。

3.2 流动相的选择 曾试验:乙腈-甲醇-水(15∶15∶10)［2-3］;甲醇-水［4-8］;甲醇-水-冰醋酸(75 ∶25 ∶0.1)［9］;以甲醇-乙腈-水为流动相，采用梯度洗脱［10］;以甲醇(A)-水(B)为流动相，采用梯度洗脱:0～5 min，A-B(30∶70);5～40 min，A-B(25∶75);40 ～45 min，A-B(32 ∶68)［11］;用以上5 种流动相测定，生脉饮中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素均达不到基线分离，再试验摸索确定以甲醇(A)-水(B)为流动相，采用梯度洗脱:0～12 min，A-B(65∶35);12 ～45 min，A-B(75 ∶25);45 ～50 min，A-B(65∶35)生脉饮中3种成分达到基线分离。

3.3 检测波长的选择 曾参考文献［2-9］检测波长选在250 nm、254 nm，结果生脉饮中五味子甲素、五味子乙素积分值较低，采用DAD在190 nm～400 nm全波长扫描，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素在220 nm均有最大吸收，故选择220 nm作为检测波长。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:653-654.

［2］吴晓凤，陈 虹.HPLC法测定生脉饮中五味子醇甲的含量［J］.中国中药杂志，2003，28(1):39-40.

［3］白淑芳，陈 虹，李灵芝.HPLC测定华中五味子中五味子甲素含量［J］.天津药学，2001，13(3):67-68.

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