响应面法优化女贞子有效成分的提取工艺

常星洁， 刘汉清， 邹建荣， 刘志辉， 王 宁， 贾 媛， 严 冬*

(1.南京中医药大学，江苏南京 210046;2.南京药业股份有限公司，江苏南京 210004;3.南京中医药大学一附院，江苏南京 210036)

女贞子为木犀科女贞属植物女贞Ligustrum lucidumAit的成熟果实，具有滋补肝肾、明目乌发之功效，用于肝肾阴虚、头昏目眩、耳鸣、腰膝疲软、须发早白等症。女贞子有效成分之一齐墩果酸为脂溶性极强的三萜类成分，国内外对其化学性质和药理作用进行了深入而系统的研究［1］。而女贞子作为传统补益药，一般采取水煎法服用，其水溶性有效成分亦不容忽视。研究表明，女贞子中的环烯醚萜类成分具有保肝利胆、抗肝纤维化、抗菌消炎、抗肿瘤、降血脂、降血糖、降低血液黏度、增强机体免疫调节等多种药理活性［2-3］。本研究以环烯醚萜类成分中含有量较高的特女贞苷和三萜类成分齐墩果酸为考察指标，进行女贞子回流提取工艺的研究，并在单因素试验基础上采用Box-Behnken响应面法，研究各因素对女贞子有效成分得率的影响。

1 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪:G1322A脱气机，G1311A四元泵，G1316A柱温箱，G1314A VWD检测器(美国Agilent公司);电子分析天平(BP-211D型，德国赛多利斯公司);DP-S24型电热恒温水浴锅(上海精弘实验设备有限公司)。

女贞子饮片购自江苏省医药公司，经江苏省中医院主任中药师周琴妹鉴定为女贞子酒制品。齐墩果酸对照品(购自中国药品生物制品检定所，定量测定用，批号:0709-9803)，特女贞苷对照品(购自南京泽郎医药科技有限公司，定量测定用，批号:ZL20100928TNZG)。测定用甲醇和乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 特女贞苷定量测定方法

2.1.1 色谱条件［4］Hedera C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相为甲醇-水(40∶60);柱温30 ℃;体积流量为1.0 mL/min;检测波长224 nm，进样量5 μL。HPLC 图谱见图1。

图1 特女贞苷对照品(A)和女贞子供试品(B)色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of specnuezhenide control and Ligustri lucidi Fructus 1.特女贞苷 1.specnuezhenide

2.1.2 标准曲线的绘制 精密称取特女贞苷10.26 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为406.4 μg/mL的对照品贮备液。精密量取该贮备液一定量，甲醇稀释成质量浓度为40.64、81.28、121.92、203.20、243.84、325.12 μg/mL 的一系列对照品溶液，按2.1.1项下色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标、样品质量浓度为横坐标绘制标准曲线。结果表明，特女贞苷在40.64～325.12 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为:Y=6.292 4X+3.585 9，r=0.999 5。

2.1.3 供试品溶液制备与测定 精密吸取女贞子提取液2 mL至10 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，0.45 μm滤膜滤过后，即得。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL注入高效液相色谱仪，测定，计算。

2.2 齐墩果酸定量测定方法

2.2.1 色谱条件［5-6］sunfire C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为乙腈-水(90∶10);柱温30℃;体积流量0.8 mL/min;检测波长 215 nm。HPLC图谱见图2。

2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取齐墩果酸对照品10.45 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容，配制成质量浓度为418.0 μg/mL对照品贮备液。取该贮备液一定量，加甲醇稀释成质量浓度为8.36、16.72、41.80、83.60、104.50 μg/mL 的一系列对照品溶液，按2.2.1项下色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标、样品质量浓度为横坐标绘制标准曲线。，8.36～104.50 g/mL面积呈良好的线性关系，回归方程为:Y=4.568 7X-1.063 5，r=0.999 8。

图2 齐墩果酸对照品(A)和女贞子供试品(B)色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of oleanolic acid control and Ligustri lucidi Fructus 1.齐墩果酸 1.oleanolic acid

2.2.3 供试品溶液制备与测定 精密吸取女贞子提取液2 mL至10 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，0.45 μm滤膜滤过后得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，测定，计算。

2.3 提取因素和相关水平的选择

2.3.1 乙醇质量分数范围的选择 取压扁女贞子20 g，分别以水、30%、50%、70%、95%乙醇为溶剂，10倍量回流提取两次，每次1 h。合并提取液，按定量测定方法制备供试品，测定特女贞苷、齐墩果酸，结果如图3(n=3)。

图3 不同乙醇质量分数对女贞子有效成分提取量的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of constituents in Ligustri lucidi Fructus

如图所示，以水为溶剂，齐墩果酸质量分数极低，提取液中几乎无法检出;以95%乙醇为溶剂，虽然齐墩果酸质量分数最高，但特女贞苷质量分数反而下降;而以50%、70%乙醇为溶剂对2个指标值均能达到较好的提取效果，所以选择乙醇质量分数的下限为50%，上限为70%。

2.3.2 提取时间范围的选择 取压扁女贞子20 g，以10倍量60%乙醇提取2次，时间分别为0.5、1、1.5、2 h，合并提取液，按定量测定方法制备供试品，测定特女贞苷、齐墩果酸，结果如图4(n=3)。可知提取1 h后，二者质量分数变化不大，考虑到多因素交互作用的影响，提取时间范围定为0.5～1.5 h。

图4 不同提取时间对女贞子有效成分提取效果的影响Fig.4 Effect of extracting time on yield of constituents in Ligustri lucidi Fructus

图5 不同料液比对女贞子有效成分提取效果的影响Fig.5 Effect of ratio of solid to liquid on yield of constituents in Ligustri lucidi Fructus

2.3.3 溶剂倍量范围的选择 取压扁女贞子20 g，分别加入4倍量、7倍量、10倍量、14倍量60%乙醇提取2次，每次1 h，合并提取液，按定量测定方法制备供试品，测定特女贞苷、齐墩果酸，结果如图5(n=3)，可知10倍溶剂时提取量较高，大于10倍增加不显著。考虑到生产成本，溶剂倍量范围定为8～12倍。

2.4 响应面试验［7-9］

2.4.1 试验设计和结果 根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，综合单因素试验结果，选取乙醇质量分数(X1)、溶剂倍量(X2)和提取时间(X3)为自变量，每个自变量的低、中、高实验水平分别以-1、0、1进行编码(表1)，实验方案及结果见表2。提取次数定为2次。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平的编码Tab.1 Factor-levels and coding for Box-Behnken design

表2 Box-Behnken试验设计与结果Tab.2 Arrangement and results of Box-Behnken design

2.4.2 模型拟合 将所得数据用Design-Expert7.1.5软件进行响应面试验分析，以综合评分为响应值Y分别对各因素X(自变量)进行多元线性回归和二项式方程拟合，回归方程为:Y=0.86+0.086X1+ 0.038X2+ 0.16X3+ 0.05X1X2-0.021X1X3+5.834E-003X2X3-0.08X12R2=0.984 4，Adj-R2=0.964 3。方差分析结果见表3。

由方差分析结果可知，本试验选择区域范围内，乙醇质量分数和提取时间对特女贞苷和齐墩果酸含，有量有极显著影响，溶剂倍量、乙醇质量分数和溶剂倍量的交互作用对其有显著影响。回归方程失拟检验不显著，表明未知因素对试验结果干扰很小。拟合检验极显著，表明该方程与实际情况拟合很好，较好地反映了特女贞苷和齐墩果酸质量分数与乙醇质量分数、溶剂倍量和提取时间的关系，所得回归方程能较好的预测女贞子有效成分随各参数的变化规律。由回归模型进行预测分析，综合评分最大预测值为1.04，最优条件为67.2%乙醇、溶剂量12倍、提取时间1.5 h。

表3 女贞子提取工艺条件响应面拟合回归方程的方差分析结果Tab.3 Analysis of variance with regression model on extraction conditions of constituents in Ligustri lucidi Fructus with RSM

2.4.3 工艺验证试验 根据响应面法优选出的工艺条件，提取女贞子3份(每份100 g)，进行工艺验证。结果见表4。二项式拟合方程预测值与实测值的偏差率=(1.04-0.95)/1.04×100%=8.7%，说明二项式拟合效果良好，可信度高。特女贞苷和齐墩果酸的转移率分别达到96.96%和97.3%(转移率=提取液中特女贞苷或齐墩果酸质量分数/饮片中特女贞苷或齐墩果酸质量分数×100%)，说明优选出的工艺提取效率高。

表4 工艺验证试验(n=3)Tab.4 Results of verification test(n=3)

3 讨论

女贞子内果皮质地坚硬，有效成分不易溶出，比较了饮片、压扁整粒和10目粉末提取液中特女贞苷和齐墩果酸质量分数，饮片中特女贞苷和齐墩果酸转移率只能达到25.14%和23.60%。压扁后内果皮破裂，有效成分几乎可以提取完全，转移率和10目粉末无显著差异。

曾尝试用梯度洗脱同时测定特女贞苷和齐墩果酸，但梯度洗脱下齐墩果酸未能与其同分异构体熊果酸分开。故采取一次提取分2次进样的方法，峰形好，分离度达到要求，操作也较为方便。

女贞子的提取工艺多以齐墩果酸为评价指标，而以特女贞苷和齐墩果酸为综合指标对女贞子提取工艺的研究尚未见报道。本实验采用Box-Behnken响应面法，通过非线性模型拟合得出最优提取条件，避免了传统的正交设计和均匀设计优化法的不足，具有实验精度高、模型预测性好的优点。

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