HPLC法测定复方苦参洗剂中盐酸小檗碱和黄芩苷

吴雪丹， 丁宝月， 傅应华*

(1.浙江省象山县第一人民医院，浙江象山 315700;2.嘉兴学院医学院，浙江嘉兴 314001)

复方苦参洗剂处方由苦参、黄柏、蛇床子、百部、黄芩等十五味中药组成，具有清热解毒、燥湿止瘙功效，用于改善妇女带下过多，外阴瘙痒等症状。原药品质量标准(试行)［1］鉴别项下规定了黄柏、黄芩的薄层色谱鉴别，定量测定项下规定了蛇床子素含有量测定，规定每1 mL含蛇床子素不得少于8 μg。黄柏有效成分之一为盐酸小檗碱［2］，黄芩有效成分之一为黄芩苷［2］，两者均具有抗菌消炎作用，需要定量控制。有关盐酸小檗碱和黄芩苷的定量测定方法主要有高效液相色谱法等［3-14］。为提高中药复方制剂质量标准，本实验对色谱条件进行了摸索，建立了HPLC法梯度洗脱同时测定复方苦参洗剂中盐酸小檗碱和黄芩苷。

1 仪器与材料

美国Dionex高效液相色谱仪由P680四元低压梯度泵，UVD170U紫外-可见检测器，ASI-100自动进样器，Chromeleon色谱数据工作站组成;BP211D电子天平(精度±0.01 mg，赛多利斯科学仪器有限公司);USC502型超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司)。

盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110713-200609，纯度98.1%)，黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110715-200815，纯度95.2%)，复方苦参洗剂样品9批(规格:100 mL相当于含生药黄柏、黄芩各1 g)，批号分别为 20110302，20110303，20110315，20110413，20110411，20110419，20110422，20110425，20110501(浙江中法制药有限公司提供 )。乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent XDB-C18柱(4.6 mm×25 cm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL中含辛烷磺酸钠0.1g)(20∶80)，维持0～3 min;在 3～17 min流动相比例线性改变至(40∶60)， 17～25 min; 1.0 mL/min;检测波长280 nm;进样量20 μL;柱温30℃。在此色谱条件下，盐酸小檗碱和黄芩苷之间以及与其它相邻杂质峰的分离度均符合要求(R＞1.5)，理论板数以黄芩苷峰计算应不低于5 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取对照品黄芩苷9.46 mg、盐酸小檗碱1.66 mg，用甲醇定容10 mL量瓶，分别制成0.946 mg/mL和0.166 mg/mL的贮备液。再精密量取适量，用甲醇稀释至黄芩苷36.02 mg/mL，盐酸小檗碱6.51 mg/mL，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密量取复方苦参洗剂5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇 15 mL，超声(功率160 W，工作频率56 kHz)处理10 min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，滤液即为供试品溶液。

2.3 阴性对照液的制备 按处方比例称取除黄柏、黄芩以外的其余药材，按照复方苦参洗剂制备工艺制备缺黄芩、黄柏的双空阴性样品。按照2.2.2项下方法操作，制成缺黄芩、黄柏的阴性对照液。

2.4 系统适用性试验 分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照液，进样分析。结果阴性对照液在盐酸小檗碱峰和黄芩苷峰位置上没有峰出现，对供试品测定无干扰。结果见图1。

2.5 线性关系考察 取0.166 mg/mL、0.946 mg/mL的混合对照品贮备液用甲醇稀释至盐酸小檗碱3.3、6.5、9.8、13.0、16.3、24.4 μg/mL，黄 芩 苷18.0、36.0、54.0、72.0、90.1、135.1 μg/mL，注入高效液相色谱仪进行测定，记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，对照品质量浓度X(μg/mL)为横坐标进行线性回归，得回归方程:盐酸小檗碱Y=0.876 5X+0.089 6，r=0.999 8;黄芩苷Y=0.998 3X+0.490 2，r=0.999 8。表明盐酸小檗碱在 3.3 ～24.4 μg/mL，黄芩苷在 18.0 ～135.1 μg/mL 。

图1 对照品(A)、复方苦参洗剂(B)和缺黄柏、黄芩阴性对照(C)的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance(A)，sample(B)and negative sample without Phellodendri chinensis Cortex and Scutellariae Radix(C)

2.6 精密度试验 取混合对照品溶液(盐酸小檗碱 6.51 μg/mL，黄芩苷 36.02 μg/mL)，重复进样 6次，结果盐酸小檗碱和黄芩苷峰面积的RSD分别为1.09%、0.93%。

2.7 重复性试验 取同一批样品(批号20110413)，平行制备6份供试品溶液，进样分析，计算盐酸小檗碱和黄芩苷质量分数的RSD分别为2.50%、1.81%。

2.8 稳定性试验 取同一批样品(批号20110413)的供试品溶液，室温放置，分别于 0、2、4、6、8，16 h 进样分析，计算盐酸小檗碱和黄芩苷峰面积的RSD分别为1.37%、1.28%。表明供试品溶液在16 h内稳定。

2.9 加样回收率试验 精密量取复方苦参洗剂阴性对照样品5 mL，共6份，各精密加入盐酸小檗碱0.116 mg/mL及黄芩苷1.106 mg/mL的混合对照品贮备液1 mL，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算盐酸小檗碱及黄芩苷的回收率，结果见表1、表2。

表1 盐酸小檗碱回收率试验结果(n=6)Tab.1 Recovery results of berberine hydrochloride in sample(n=6)

表2 黄芩苷回收率试验结果(n=6)Tab.2 Recovery results of baicalin in sample(n=6)

2.10 样品测定 取9批样品，制备供试液，进样分析，记录色谱图，按外标法峰面积计算盐酸小檗碱及黄芩苷的质量浓度，结果见表3。

表3 样品中盐酸小檗碱和黄芩苷测定结果(n=3)Tab.3 Determination of baicalin and berberine hydrochloride in lotions samples(n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择 以甲醇为溶剂，分别测定了盐酸小檗碱和黄芩苷的紫外光谱图，盐酸小檗碱最大吸收波长为266 nm，黄芩苷最大吸收波长为275 nm。两者在波长280 nm处有等吸收点，实验选择280 nm作为检测波长，盐酸小檗碱和黄芩苷均有较，， 。

3.2 溶剂的选择 复方苦参洗剂为经水煎煮制成的中药制剂，水溶性杂质较多，在进样前需经纯化处理。采用甲醇作溶剂，沉淀物较松，易于过滤;而采用乙醇作溶剂，沉淀物呈黏稠状，不易过滤，故选择甲醇作溶剂。

3.3 提取时间的选择 取样品分别超声处理5、10、15、20 min，制备供试液，测定盐酸小檗碱和黄芩苷，结果超声处理10、15、20 min含有量无差异，故确定超声处理为10 min。

3.4 溶剂用量的选择 取样品5 mL，分别加入甲醇10、15、20 mL，制备供试品液，测定盐酸小檗碱和黄芩苷，结果溶剂用量10、15、20 mL含有量无差异，确定甲醇用量为15 mL。

3.5 流动相系统的优化 试验发现，当采用乙腈-0.1%磷酸系统作流动相，乙腈比例为50%时，黄芩苷保留时间为2.7 min，盐酸小檗碱23 min未出峰;在0.1%磷酸中加入0.1%辛烷磺酸钠，保持乙腈比例不变，黄芩苷保留时间不变，盐酸小檗碱保留时间为4.4 min，而降低乙腈比例，黄芩苷、盐酸小檗碱保留时间均延长。考虑到复方制剂成分复杂，采用梯度洗脱更能调整好黄芩苷、盐酸小檗碱两组分出峰时间，经反复修改有机相比例，优化各组分的分离度，达到黄芩苷、盐酸小檗碱与相邻组分峰分离度均符合规定，确定的梯度洗脱程序具有重复性好、柱效高、出峰速度快等优点。另对磷酸与辛烷磺酸钠的浓度进行考察，结果表明，在分离度满足要求的前提下，尽量减少磷酸和辛烷磺酸钠的质量浓度，以0.1%磷酸和0.1%辛烷磺酸钠为宜。同时，试验也表明，色谱柱选用25 cm长柱较好，可增加各组分的保留值，有利于各组分的分离。

3.6 含量限度的拟定 从表3中9批样品的测定结果看，黄芩苷、盐酸小檗碱质量浓度差异较大，黄芩苷质量浓度范围在0.016 1～0.039 1 mg/mL之间;盐酸小檗碱质量浓度范围在0.158 9～0.256 6 mg/mL之间。为了使产品质量可控，提高疗效，质控标准中应增加黄芩苷、盐酸小檗碱定量测定项目，考虑到不同产地黄芩、黄柏中黄芩苷、盐酸小檗碱质量浓度的差异，拟定样品中黄芩苷、盐酸小檗碱质量浓度应不低于0.20 mg/mL和0.020 mg/mL。

［1］WS-5412(B-0412)-2002.国家药品监督管理局标准(试行)［S］.

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