补肾健脾复方对流产大鼠蜕膜Fas/FasL表达干预的实验研究*

刘明珠，许丽绵

(1.郑州大学第一附属医院，河南郑州450052;2.广州中医药大学，广东广州510405)

自然流产是妇产科常见病之一，发病率有逐年增长趋势，且多数为早期流产。自然流产的发病原因除了遗传基因缺陷、内分泌异常、全身性疾病、生殖器官异常、感染等方面外，随着近代免疫学研究的进展，更多的医学者把目光聚焦在免疫因素方面，通过对生殖道特别是子宫局部免疫状况的研究，认识到母胎界面免疫微环境的改变对妊娠有巨大的影响，如母胎界面Fas/FasL表达的异常可以引起子宫局部免疫微环境的破坏使妊娠失败而流产。本实验以羟基脲和米非司酮建立肾虚黄体抑制流产大鼠模型［1］，通过补肾健脾复方对肾虚黄体抑制流产模型大鼠子宫蜕膜组织Fas/FasL表达的干预，探讨补肾健脾中药在防治自然流产的过程中对子宫免疫微环境的影响，进而揭开中药安胎的机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级成熟SD大鼠，雌性64只，8～10周龄，体质量250～300 g;雄性32只，10～12周龄，体质量350～380 g。两者均购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号为SCXK(粤)2003－0001，粤监证字2006A014。

1.2 药品、试剂与仪器

补肾健脾复方，由菟丝子、川续断、桑寄生、党参、北黄芪等8味药组成，由广州中医药大学第一附属医院制剂科制备提供。根据大鼠与人的药量换算公式，按每只大鼠体质量8 μL/(g·d)进行计算，浓缩后每只大鼠每天的中药量相当于50 kg体质量的人2剂/d的药量。羟基脲，规格0.1 g/片，上海中西制药有限公司产品，批号 H19990263;米非司酮，规格25 mg/片，上海医药有限公司华联制药厂产品，批号H10950202;黄体酮注射液，规格10 mg/1 mL/支，天津金耀氨基酸有限公司产品，批号H12020534;Rabbit Anti－FAS( 批 号 BA0484)、Rabbit Anti－FASL(批号BA0049)，均购自武汉博士德生物工程公司;DAB显色试剂盒(棕黄色，批号AR1022)、S－P免疫组化染色试剂盒(批号30577916)，均购自中山生物试剂有限公司。AXIOSTAR PLUS型光学显微镜，德国Zeiss公司产品;TP1020型徕卡生物组织自动脱水机、EG1140型徕卡石蜡包埋机、RM2050型徕卡石蜡切片机，德国Leica－徕卡产品。

1.3 动物分组、模型的建立与给药

将雌雄大鼠按2∶1比例合笼。每天观察雌鼠阴道涂片。以阴道涂片出现精子计为妊娠第1天。将48只雌性大鼠随机分为正常妊娠组、补肾健脾方组、黄体酮组、模型组4组，每组各12只。正常妊娠组从妊娠第1天起给予生理盐水8 μL/(g·d)灌胃，连续11 d。除正常妊娠组外，其余大鼠均于妊娠第1到第10天灌服羟基脲(450 μg/g)，第11天灌服米非司酮(3.75 μg/g)，灌服米非司酮24 h后处死动物。在造模的同时，补肾健脾方组从妊娠第1天起给予补肾健脾方药8 μL/(g·d)灌胃，连续10 d。黄体酮组从妊娠第1天起肌注黄体酮针8 μL/(g·d)，隔天1次，连续 10 d。模型组从妊娠第1天起生理盐水8 μL/(g·d)灌胃，连续10 d。

1.4 检测指标

检测肾虚黄体抑制流产大鼠模型子宫蜕膜组织的Fas和FasL表达。于大鼠妊娠第12天，解剖各组大鼠，使子宫离体，取蜕膜组织，用免疫组织化学S－P法检测孕鼠子宫蜕膜组织Fas和FasL表达;并常规HE染色，用免疫组织化学S－P法检测Fas和FasL表达。

1.4.1 免疫组织化学法操作步骤

①取实验大鼠子宫的蜕膜组织放入100 g/L福尔马林固定，常规包埋，石蜡切片，用防脱片剂处理过的载玻片捞取切片，经纯二甲苯脱腊2次，每次6 min;梯度乙醇脱二甲苯各2 min。自来水、PBS漂洗2 min×3次。加30 g/L H2O2阻断内源性过氧化物酶，室温下作用10 min;热修复抗原，滴加50 g/L BSA封闭液，室温20 min。滴加1∶150稀释的一抗，Rabbit Anti－FAS、Rabbit Anti－FASL 抗体，37 ℃ 恒温箱内1 h;取1张切片用PBS液代替一抗作阴性对照。PBS冲洗，3 min×3次，滴加生物素化二抗、山羊抗兔IgG，37℃恒温箱内20 min。PBS(pH值 7.2～7.6)洗涤2 min×3次。

滴加试剂SABC，37℃恒温箱内20 min。PBS(pH值7.2～7.6)洗涤5 min×4次。PBS洗后加入DAB，显色1～5 min。苏木素浅复染，常规脱水、封片、分析结果。

1.4.2 结果判断

HE染色结果:细胞核呈蓝色，细胞浆、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色，钙盐和各种微生物染成蓝色或蓝紫色。结果的判定是光镜下观察各组胞浆或胞膜内棕黄色颗粒为阳性标准，每张切片随机取5个高倍视野。结果评定标准:与背景比，“－”为细胞内无棕黄色阳性颗粒或呈与背景均匀一致的很淡黄色;“+”为细胞膜和细胞浆内可见淡棕黄色颗粒;“++”为细胞膜和细胞浆内可见清晰棕黄色颗粒;“+++”为细胞膜和细胞浆内见深棕黄色颗粒。根据显色强度分别计为0，1，2，3分;并计算阳性细胞数所占整个视野的百分比即阳性率，用%表示，染色强度指数(SⅡ)=阳性率×强度计数。

1.5 统计学方法

采用SPSS 12.0统计分析软件处理。计量资料数据以均数()±标准差(s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较用配对 t检验。以 P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

4组肾虚黄体抑制大鼠流产模型蜕膜组织细胞中均有Fas及FasL阳性表达，主要集中在细胞膜及细胞浆中。

2.1 各组大鼠蜕膜组织Fas表达染色强度指数对比

与正常妊娠组对比，模型组蜕膜组织细胞Fas表达的平均染色强度指数明显增高，差别有统计学意义(P＜0.01)。与模型组对比，补肾健脾方组Fas表达平均染色强度指数减低(P＜0.01)，黄体酮组Fas表达平均染色强度指数减低(P＜0.05)。补肾健脾方组、黄体酮组和正常妊娠组对比，Fas染色强度指数变化不明显，差别无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠蜕膜组织Fas表达染色强度指数对比±s

表1 各组大鼠蜕膜组织Fas表达染色强度指数对比±s

注:与模型组对比，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;与正常妊娠组对比，##P ＜0.01。

组动物数 平均染色强度指数正常妊娠组 10 0.38±0.06别*模型组 12 0.84±0.13##黄体酮组 12 0.41±0.07*补肾健脾方组 12 0.38±0.07＊＊

2.2 各组大鼠蜕膜组织FasL表达染色强度指数对比

与正常妊娠组对比，模型组子宫蜕膜组织细胞FasL的平均染色强度指数降低，差别有统计学意义(P＜0.05)。与模型组对比，补肾健脾方组及黄体酮组FasL表达均增高，差别有统计学意义(P＜0.05)。补肾健脾方组、黄体酮组与正常妊娠组对比，FasL染色强度指数变化不明显，差别无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 各组大鼠蜕膜组织FasL表达染色强度指数对比±s

表2 各组大鼠蜕膜组织FasL表达染色强度指数对比±s

注:与模型组对比，* P＜0.05;与正常妊娠组对比，#P＜0.05。

组动物数 平均染色强度指数正常妊娠组 10 0.48±0.08别*模型组 12 0.27±0.03#黄体酮组 12 0.49±0.05*补肾健脾方组 12 0.45±0.06*

3 讨论

Fas即Apo－1或CD95，是TNF/NGF受体家族Ⅰ型膜蛋白，Fas配体FasL是Ⅱ型膜蛋白。Fas做为一种普通表达的受体分子，可出现在包括淋巴细胞的多种细胞表面，而FasL的表达却通常只出现在活化的T细胞(特别是活化的CTL)和NK细胞上。已被活化的杀伤性免疫细胞往往能够最有效地以凋亡途径杀死靶细胞，但表达FasL的效应杀伤细胞会与自身表达的Fas结合，诱导自身的凋亡过程，此被称为活化诱导的细胞凋亡(AICD)［2］。

多数研究［3－4］发现:Fas/FasL在母胎免疫耐受中起重要作用，即表达FasL的绒毛滋养细胞能够杀伤入侵到胎盘绒毛的Fas淋巴细胞，从而使滋养细胞免受母体免疫细胞的破坏。因此滋养细胞FasL表达异常或者淋巴细胞Fas表达异常都可能导致胎盘部位免疫耐受的破坏从而引起自然流产。

根据中医“肾主生殖”“肾藏生殖之精”“又藏水谷之精气”的理论，对临床上免疫调节异常的流产，中医辨证为脾肾虚弱、胎元不固，治疗多采用补肾健脾的方药。从组方上看，菟丝子性温味甘，归肝肾脾经，平补肾阴肾阳，补而不燥，滋而不腻。黄芪性微温味甘，归脾肺经，补气健脾。两药一补肾，一健脾，先后天气血双补。桑寄生既可补肝肾养血，又能固冲任安胎。续断补肝肾强筋骨，调冲任，止血安胎。党参性平味甘，归脾肺经，助北芪补中益气，生津养血。诸药合用，具有补肾健脾、益气养血、调冲安胎的作用。

本研究采用免疫组化方法对肾虚黄体抑制流产孕鼠和正常孕鼠的蜕膜组织表面Fas/FasL表达进行研究，均在蜕膜组织检测到Fas和FasL的表达，并且肾虚黄体抑制流产孕鼠蜕膜组织细胞FasL表达强度明显低于正常孕鼠，Fas表达明显高于正常孕鼠。一方面，FasL表达的降低使受异体抗原刺激增生的Fas阳性T淋巴细胞凋亡数量减少，使流产蜕膜细胞Fas表达明显增强;同时Fas表达增高又进一步消耗FasL，形成恶性循环;此外，FasL表达降低又使Fas/FasL介导的AICD机制平衡失调，大量被激活的T淋巴细胞破坏了蜕膜表面的免疫赦免，免疫应答过强造成母胎界面免疫损伤，从而影响妊娠的继续。本研究表明，补肾健脾复方、黄体酮可以增加肾虚黄体抑制流产孕鼠蜕膜组织FasL表达强度、降低Fas表达强度，且补肾健脾复方的作用和黄体酮对比，差别无统计学意义(P＞0.05)。由此推断，补肾健脾中药可能一方面通过增加FasL的表达，使受异体抗原刺激增生的Fas阳性T淋巴细胞及时凋亡，使滋养细胞免受淋巴细胞的攻击;另一方面通过降低Fas表达，使Fas/FasL介导的AICD机制恢复平衡协调，从而起到安胎的作用。

［1］宁艳，罗颂平，梁国珍.补肾健脾中药复方对肾虚黄体抑制妊娠大鼠流产模型的实验研究［J］.中国医药学报，2000，15(6):428 －430.

［2］Medena JP，Scaffidi C，Kischkel ME，et al.FLICE is activated by association with the CD95 death－inducing signaling complex［J］.EMBO J，1997，16:2794.

［3］刘玉昆，张建平，邝健全，等.Fas/FasL在复发性自然流产患者中的表达［J］.中山大学学报:医学科学版，2004，25(6):581－585.

［4］Kauma SW，Huff TF，Hayes N.Placental Fas Ligand expression is a mechanism for meternal immune tolerance to the fetus［J］.J lin ndocrino Metab，1999，84(6):2188 －2194.