高效液相色谱法测定老年咳喘片中淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素的含量

王晓燕

(河南省食品药品检验所，河南郑州450003)

老年咳喘片是由黄芪、白术、防风、甘草、黄精、淫羊藿、补骨脂等7味中药组成，具有滋阴壮阳、扶正固本、提高免疫能力、促进病体康复的功效，用于老年慢性支气管炎及各种体虚症［1］。原标准收载于部颁标准《中药成方制剂》第九册，无定量检测方法。淫羊藿和补骨脂是方中用量较大的重要药物。淫羊藿属植物的化学成分目前报道有70多种，主要是黄酮类，如淫羊藿苷。淫羊藿苷除具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效外，还有镇咳、祛痰与平喘作用［2］。王淑云［3］研究发现，补骨脂中的香豆素类可明显提高过敏性哮喘阈，对哮喘有明显的拮抗作用。补骨脂素和异补骨脂素即属呋喃香豆素类成分。有关老年咳喘片中淫羊藿苷的含量测定［4－5］及补骨脂素、异补骨脂素的含量测定均有报道［6］。现建立本品中补骨脂和淫羊藿两味药材的检测方法，同时测定淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素的含量，以快速有效地控制老年咳喘片的质量。

1 药品、试剂与仪器

老年咳喘片，郑州羚锐制药股份有限公司产品，批号110104，110105，110106。淫羊藿苷对照品(批号110737－200114)、补骨脂素对照品(批号110739－200613)、异补骨脂素对照品(批号110738－200309)，均由中国药品生物制品检定所提供，均为含量测定用;水为高纯水。Waters 2690高效液相色谱仪，Waters 996二极管阵列检测器，均为美国Waters公司产品;M32色谱工作站。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

HypersIL C18柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm)，柱温40℃，流动相为乙腈－1g/L磷酸(30∶70)，体积流量1.0 mL/min，检测波长260 nm，进样量10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂对照品适量，制成含量分别为 0.132 8，0.036 6，0.037 8 g/L的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品40片，除去薄膜衣，研细。取约5 g，精密称定，置锥形瓶中，加入甲醇25 mL，称定质量;置水浴上加热回流40 min，放冷;再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取2.2项下混合对照品溶液3，5，7，10，15，20 μL，分别注入液相色谱仪，按上述条件分别测定峰面积积分值，以进样量为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，进行回归处理。结果:淫羊藿苷进样量在0.398 4～2.656 μg范围内，线性关系良好，回归方程为 Y=1.626×106X －37 402，r=0.999 7;补骨脂素进样量在0.109 8～0.732 0 μg范围内，线性关系良好，回归方程为Y=3.012×106X－24 186，r=0.999 7;异补骨脂素进样量在0.113 4～0.756 0 μg范围内，线性关系良好，回归方程为Y=3.60×106X －33 556，r=0.999 8。

2.5 阴性对照试验

分别取方中缺淫羊藿和补骨脂外其他药物，按老年咳喘片处方比例和工艺分别制备缺淫羊藿和缺补骨脂阴性对照物，按供试液制备方法制成缺淫羊藿阴性对照液和缺补骨脂阴性对照液。分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，见图1。结果:供试品溶液色谱中，在与淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素对照品色谱相应的位置上有吸收峰，而缺淫羊藿和缺补骨脂阴性对照溶液则在相应的保留时间无吸收峰出现。结果表明，其他药物对含量测定无影响。

图1 含量测定HPLC色谱图

2.6 稳定性试验

取批号110104的样品，按上述方法制备供试品溶液，吸取10 μL，分别在 0，2，4，6，8 h 注入液相色谱仪，测其峰面积，取8 h的测定结果。结果:淫羊藿苷的平均峰面积为2 032 098，RSD=0.43%;补骨脂素的平均峰面积为614 933，RSD=0.32%;异补骨脂素的平均峰面积为1010 723，RSD=0.29%。

2.7 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液10 μL，重复进样6次，测定峰面积。结果:淫羊藿苷平均峰面积为2 014 610，RSD=1.21%;补骨脂素平均峰面积为609 852，RSD=1.28%;异补骨脂素平均峰面积为1 009 521，RSD=1.18%。

2.8 重复性试验

取同一批样品(批号110104)，制备6份供试品溶液，按上述方法重复平行测定。结果:淫羊藿苷平均含量为0.631 mg/g，RSD为2.01%;补骨脂素平均含量为0.118 9 mg/g，RSD为2.32%;异补骨脂素平均含量为0.145 mg/g，RSD为2.29%。

2.9 回收率试验

取已知含量的样品(淫羊藿苷含量为0.631 mg/g，补骨脂素含量为0.118 9 mg/g，异补骨脂素含量为0.145 0 mg/g)，研细，取约2.5 g，精密称定;精密加入淫羊藿苷对照品约1.5 mg，补骨脂素对照品溶液(0.366 g/L)和异补骨脂素对照品溶液(0.378 g/L)各1 mL及甲醇23.0 mL;按2.3项下供试品溶液制备方法操作，制成加样供试品溶液。吸取加样供试液10 μL，注入液相色谱仪，按上述方法测定加样供试液中含量，计算回收率。结果见表1～3。

表1 淫羊藿苷回收率试验结果

表2 补骨脂素回收率试验结果

表3 异补骨脂素回收率试验结果

2.10 样品测定

取3批样品，按2.3项下方法操作，制备供试品溶液，依法测定，重复测定3次，结果见表4。

表4 3批样品含量测定结果 n=3

3 讨论

在本试验中，曾试用甲醇 －水(50∶5 0)，甲醇－1 g/L磷酸溶液(50∶50)、乙腈－1 g/L磷酸溶液(40∶60)、乙腈－1 g/L磷酸溶液(35∶65)、乙腈－1 g/L磷酸溶液(30∶70)等条件，经反复比较，最终确定乙腈－1g/L磷酸溶液(30∶70)为最佳色谱条件，色谱重复性好，3种待测成分出峰时间适宜，峰形对称，且与相邻峰分离度较好。

笔者对提取方法和提取时间也进行了考察。分别用乙醇超声、乙醇回流和甲醇回流进行提取制备的供试品，测定含量结果显示，甲醇回流提取待测成分含量最高。分别测定了回流提取30，40，50 min制备的供试品，结果显示，提取40 min制备的供试品溶液含量最高，加热回流50 min时各成分含量明显下降。因此，最终选择甲醇加热回流40 min的提取方法制备供试品溶液。

本实验中分别对淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素色谱峰进行吸收光谱扫描，结果淫羊藿苷在270 nm下有最大吸收，补骨脂素和异补骨脂素在246 nm下有最大吸收。此与2010版《中国药典》一部中淫羊藿和补骨脂药材项下的测定波长一致。因此，选择 0 ～15 min、270 nm 和15 ～25 min、246 nm分别作为淫羊藿苷与补骨脂素、异补骨脂素的检测波长。采用M32色谱工作站的定时波长功能，选取15 min为检测波长转换点，使检测波长由270 nm变为246 nm，在同一色谱条件下同时检测本品中淫羊藿苷和补骨脂素类成分。此法不仅可以用于DAD检测器，也可用于普通的多波长紫外检测器，具有普遍适用性，方便快速。

采用高效液相色谱法同时测定老年咳喘片中淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素的含量，方法简便、快捷、重现性好，可更科学、更全面的对老年咳喘片进行质量评价。

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药品标准中药成方制剂:第九册［S］.1994:70.

［2］李花.淫羊藿药理作用的研究现状及展望［J］.现代医药卫生，2008，24(22):3413.

［3］王淑云.补骨脂的药理作用研究概况［J］.时珍国医国药，2006，17(6):1081.

［4］李志红，付彬，石国明.高效液相色谱法测定老年咳喘片中淫羊藿苷含量［J］.中国药业，2010，19(6):28.

［5］刘灿辉，谭浩军.高效液相色谱法测定老年咳喘片中淫羊藿苷含量［J］.中国药业，2009，18(18):39.

［6］覃建明，莫文电，谭忠谋.RP－HPLC法测定老年咳喘片中补骨脂和异补骨脂的含量［J］.世界中医药，2010，5(3):75.