寿胎丸对大鼠卵巢移植术后体质量及E2 分泌的影响*

朱淑惠，罗颂平，邓煜燎

(1. 广州中医药大学门诊部，广东 广州510405;2.广州中医药大学第一附属医院妇科教研室，广东 广州510405)

卵巢是女性重要的生殖和内分泌器官，随着20 世纪90 年代卵巢冷冻保存技术和移植免疫学的发展，卵巢移植受到医者越来越多的重视。影响移植成功的关键在于控制移植后的排斥反应，延长移植卵巢的存活时间。近年来，随着中药免疫药理研究的逐渐深入，中药抗移植排斥作用的研究也取得了一定的进展。寿胎丸出自《医学衷中参西录》，由菟丝子、桑寄生、续断、阿胶4 味中药组成，具有补肾气、固冲任、调气血、安胎的作用。寿胎丸用于抗器官移植后免疫排斥反应的思路主要源于对反复自然流产的治疗。对于母体而言，胎儿相当于同种半异体移植物，而自然流产可视为母体对胎儿的一种免疫排斥反应。本课题建立SD 和Wistar 大鼠间同种异体卵巢移植模型，并建立Wistar 大鼠自体卵巢移植模型作对照，观察补肾复方寿胎丸对同种大鼠自体及异体卵巢移植的影响，从移植模型体质量及雌二醇(E2)的变化来探讨补肾复方寿胎丸抗卵巢移植排斥反应的机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

Wistar 大鼠210 只，由南方医科大学实验动物中心提供，动物合格证号为0047261，0048981，0049554，0050275，0050721，0050814。SD 大鼠120 只，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号为0049729，0051023。大鼠均为雌性，SPF 级，10～12周龄，体质量180～230 g，饲养于SPF 级实验室，照明时间12 h/d(8:00—20:00)，相对湿度55% ±10%，温度(22 ±2)℃，以消毒大鼠专用饲料和洁净水饲养。

1.2 药品、试剂与仪器

寿胎丸由菟丝子、桑寄生、续断、阿胶4 味中药组成，均购于康美药业有限公司。每剂含生药材200 g，按菟丝子∶桑寄生∶续断∶阿胶=4 ∶3∶3∶1的比例，将菟丝子、桑寄生、续断3 味药加水750 mL，煎至150 mL，阿胶烊化，浓缩至100 mL，含生药量2 g/mL。环孢A(CsA，新赛斯平软胶囊)，25 mg/粒，杭州中美华东制药有限公司产品，批号090324，将之溶于适量蒸馏水中，定容为2 mg/mL 备用。E2免疫反应试剂，购自上海蓝怡科技有限公司;1640 培养液、四季青新生牛血清、Sucrose、DMSO、100 mm 培养皿、水合氯醛、多聚甲醛、玻璃毛细管、苦味酸等，均购自广州威佳科技有限公司。AIA－1800 全自动免疫分析仪，日本东曹株式会社产品;Kryo320－1.7 程序降温仪，英国Planer 公司产品;高精度加液器及吸头(2～20 μL、20～200 μL、200～1000 μL)、－20 ℃低温冰箱、冷冻离心机、4 ℃冰箱、液氮及液氮罐、冻存管、玻璃试管、EP 管、记号笔、水浴箱、眼科手术器械等，均由广州中医药大学妇科实验室提供。

1.3 动物分组、模型的建立与给药

取Wistar 大鼠210 只，随机分为自体移植模型组、自体移植+寿胎丸组、异体移植模型组、异体移植+寿胎丸组、异体移植+环孢A(CsA)组、异体移植+ CsA + 寿胎丸组和正常对照组7 组，每组30 只。除正常对照组仅行腹部切开缝合外，其余各组大鼠以100 g/L 水合氯醛进行腹腔注射麻醉，下腹部消毒，正中线切口，腹腔探查并摘除双侧卵巢，结扎残端，术后伤口涂红霉素软膏抗感染。术后第5 天起，每天行细胞学涂片，连续9 d，涂片显示无周期性变化，提示去势彻底。

取出大鼠卵巢后，立即置于4 ℃含体积分数10%胎牛血清的1640 基础培养液中，洗去血迹，用手术刀片将系膜去掉，冷冻保存。冻融方案采用Oktay 等1998 年提出的慢冻—快融经典方案［1］。异体移植组:于偏离Wistar 大鼠原手术切口约0.5 cm 处纵行切开1 cm，将SD 大鼠的双侧卵巢分别移植于Wistar 大鼠切口两侧的腹壁上，缝合皮肤，伤口涂红霉素软膏抗感染［2］。自体移植组:采用快融法复苏冷冻卵巢［1］后，参照异体移植组手术方案移植。自体移植+寿胎丸组和异体移植 + 寿胎丸组均给予寿胎丸26.8 g/(kg·d)，28 d;异体移植+ CsA 组，给予CsA 10 μg/(g·d)，连用14 d 后，6 μg/(g·d)再连用14 d;异体移植+ CsA + 寿胎丸组，给予CsA 6 μg/(g·d)和寿胎丸26.8 g/(g·d)，连用28 d;自体移植模型组、异体移植模型组和正常对照组均给予等量生理盐水28 d。各组均灌胃给药。移植术后24 h 第1 次给药，以后每隔24 h 给药1 次。

1.4 检测指标

1.4.1 体质量

移植术前1 日及移植术后第7，14，21，28，35 天时测量各组大鼠的体质量并记录。

1.4.2 动情情况

通过阴道细胞涂片检测。移植术前了解去势后的Wistar 鼠的去势情况。去势术后第5 天起，每天行细胞学涂片检查，连续9 d。若涂片显示无周期性变化，提示去势彻底。移植术后第5 天开始行阴道细胞涂片，于10 ×10 倍光学显微镜下观察，取5 个不同视野，计算白细胞、有核细胞、角化细胞各占百分数。若满视野均为角化细胞，则认为动物出现动情周期。

1.4.3 血清E2水平

移植术前1 日，自眼眶后静脉丛取血检测去势后的血清E2水平。移植术后第6～15 天、第16～25 天以及第26～35 天，根据阴道涂片，选动情第1 天取血，以全自动电化学发光免疫分析仪自动完成全部检测步骤。

1.5 统计学方法

采用SPSS 15.0 统计分析软件处理。计量资料数据以均数()±标准差(s)表示，两组组间比较采用t检验，多组比较根据设计不同分别采用单因素方差分析和析因设计的方差分析，多重比较用q检验。以P＜0.05 为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠不同时点体质量对比

在移植后14 d，自体移植模型组大鼠体质量与异体移植模型组、异体移植+寿胎丸组、正常对照组对比，差别有统计学意义(P＜0.05);其余各组在各时点对比，差别均无统计学意义(P＞0.05)。自体移植寿胎丸组、异体移植模型组各有1 只大鼠因移植术前取血时麻醉过深致死，异体移植模型组另有1只大鼠因移植术后肠梗阻死亡，死亡大鼠未纳入统计。见表1。

表1 各组大鼠不同时点体质量对比 g，±s

表1 各组大鼠不同时点体质量对比 g，±s

移植前1 d 移植前7 d 移植前移植前21 d 移植前28 d 移植前35 d分 组14 d动物数动物数 体质量自体移植模型组 30 213.50±9.55 30 217.20±13.71 24 216.79±20.63 18 226.17±9.54 12 236.58±9.010 6 243.17±8.动物数 体质量动物数 体质量体质量动物数 体质量动物数 体质量232自体移植寿胎丸组 29 211.20±11.70 29 219.47±14.78 24 223.88±15.19 18 227.94±13.53 12 245.17±11.595 6 245.17±12.624异体移植模型组 28 216.50±9.40 28 220.20±11.38 23 229.17±13.52* 18 231.78±13.06 12 242.33±15.899 6 247.00±14.227异体移植+寿胎丸组 30 213.43±9.79 30 217.87±10.76 24 229.83±12.40* 18 235.89±13.87 12 240.50±13.787 6 248.17±19.219异体移植+CsA 组 30 212.27±11.81 30 214.93±14.14 24 220.71±12.28 18 236.06±17.63 12 242.17±16.776 6 250.17±27.088异体移植+CsA+寿胎丸组 30 212.23±9.71 30 218.23±9.71 24 223.58±12.29 18 229.89±14.27 12 239.67±13.620 6 242.83±13.615正常对照组 30 209.17±10.48 30 220.57±9.67 24 228.63±9.97* 18 234.94±11.52 12 241.94±11.260 6 246.17±11.125

注:与自体移植模型组同期对比，*P＜0.05。

2.2 各组大鼠动情情况对比

自体移植模型组30 只大鼠中动情21 只，自体移植寿胎丸组29 只中动情22 只，异体移植模型组28 只中动情0 只;异体移植+寿胎丸组30 只中动情5 只，异体移植+CsA 组30 只中动情8 只，异体移植+CsA+寿胎丸组30 只中动情10 只，正常对照组30 只中动情30 只。

2.3 各组大鼠血清E2 水平对比

2.3.1 自体移植与异体移植模型大鼠不同时点E2水平对比

除移植前1d 这个时点外，其余3 个时点，异体移植模型组的E2水平均较自体移植模型组低，差别有统计学意义(P＜0.05)。自体移植模型组后2 个时点的E2水平、异体移植模型组后3 个时点的E2水平均较正常对照组低，差别有统计学意义(P＜0.05)。提示:异体卵巢移植后发生了严重的急性排斥反应，自体卵巢移植过程中的冻融损伤、缺血缺氧损伤等因素也影响到移植卵巢的长期存活。见表2。

表2 自体移植与异体移植模型大鼠不同时点E2 水平对比 pmol·L －1，±s

表2 自体移植与异体移植模型大鼠不同时点E2 水平对比 pmol·L －1，±s

注:与自体移植模型组同期对比，* P＜0.05;与正常对照组同期对比，# P＜0.05。

分 组1d动物数 E移植前2移植后第6～15天动物数 E 2移植后第16～25天动物数 E 2移植后第26～35天动物数 E 2自体移植模型组 30 46.52 ±22.11 30 76.81 ±23.18 18 70.14 ±20.27# 12 69.78 ±18.78#异体移植模型组 28 45.57 ±28.56 28 37.08 ±12.72* # 18 29.47 ±15.96* # 12 32.26 ±11.39* #正常对照组 30 58.18 ±13.27 30 88.27 ±27.52 18 101.40 ±23.81 12 108.05 ±36.80

2.3.2 自体卵巢移植两组大鼠不同时点E2水平对比

两组各时点的E2水平对比，差别均无统计学意义(P＞0.05)。提示寿胎丸在提高自体移植卵巢成活率、促进内分泌功能恢复等方面疗效不明显。见表3。

表3 自体移植模型组与自体移植+寿胎丸组大鼠不同时点E2 水平对比 pmol·L －1，±s

表3 自体移植模型组与自体移植+寿胎丸组大鼠不同时点E2 水平对比 pmol·L －1，±s

分 组1d动物数 E移植前2移植后第6～15天动物数 E 2移植后第16～25天动物数 E 2移植后第26～35天动物数 E 2自体移植模型组 30 46.52 ±22.11 30 76.81 ±23.18 18 70.14 ±20.27 12 69.78 ±18.78自体移植+寿胎丸组 29 40.65 ±16.98 29 70.19 ±22.01 18 79.04 ±22.34 12 76.69 ±37.42

2.3.3 异体卵巢移植各组大鼠不同时点E2水平对比

对异体卵巢移植各组做单因素方差分析，移植前1 d，各组的E2水平对比，差别均无统计学意义(P＞0.05);移植后第6～15 天、第16～25 天、第26～35 天，异体移植+CsA 组、异体移植+CsA +寿胎丸组的E2水平高于异体移植模型组和异体移植+寿胎丸组(P＜0.05);移植后第6～15 天、第26～35天，异体移植+CsA+寿胎丸组的E2水平高于异体移植+CsA 组(P＜0.05);异体移植+寿胎丸组的E2水平和异体移植模型组对比，在移植后各时点差别均无统计学意义(P＞0.05)。经析因设计的方差分析，在移植后第6～15 天、第16～25 天，CsA 的主效应有统计学意义(P＜0.05)，提示:CsA 可提高大鼠异体卵巢移植后的E2水平，寿胎丸与CsA 的交互作用是正向的。移植后第26～35 天，CsA 与寿胎丸的主效应差别均有统计学意义(P＜0.05)，提示:CsA 和寿胎丸均有抗移植排斥的作用，但单用寿胎丸，尚不能逆转排斥。见表4。

表4 异体卵巢移植各组大鼠不同时点E2 水平对比 pmol·L －1，±s

表4 异体卵巢移植各组大鼠不同时点E2 水平对比 pmol·L －1，±s

分 组1d动物数 E移植前2移植后第6～15 天#△动物数 E 2移植后第16～25 天#动物数 E 2移植后第26～35 天*#动物数 E 2异体移植模型组 28 45.57 ±28.56 28 37.08 ±12.72 18 29.47 ±15.96 12 32.26 ±11.39异体移植+寿胎丸组 30 44.84 ±20.75 30 25.99 ±14.81 18 31.20 ±10.20 12 40.86 ±18.52异体移植+CsA 组 30 47.47 ±15.75 30 67.89 ±28.44※◆ 18 80.35 ±25.95※◆ 12 72.73 ±23.08※◆异体移植+CsA+寿胎丸组 30 50.35 ±10.02 30 88.63 ±33.00※◆☆ 18 90.86 ±32.75※◆ 12 97.07 ±35.45※◆☆

3 讨 论

3.1 寿胎丸的现代药理研究

寿胎丸为补肾安胎之代表方。方中重用菟丝子为主药，菟丝子性柔润而多液，可平补肾阴肾阳。该药补而不燥，滋而不腻，为安胎之首选药物。《神农本草经》列其为上品，主治“续绝伤，补不足，益气力，肥健人”。续断补肝肾安胎，据药理学研究，其有抗维生素E 缺乏症的作用而利于孕卵发育。桑寄生补肝肾，兼养血安胎。阿胶能补血滋阴止血安胎。全方具有补肾气、固冲任、调气血、安胎的作用。临床用于治疗先兆流产、反复自然流产疗效确切、显著［3－6］。有研究证明，寿胎丸能促进小鼠幼鼠的子宫和卵巢发育，对正常和妊娠大鼠离体子宫平滑肌的收缩频率和活动力有明显抑制作用［7］。加味寿胎丸复方能提高妊娠期血清孕激素水平和子宫蜕膜孕激素受体(PR)的表达，改善患者外周血淋巴细胞亚群失衡，调节免疫功能，降低流产率［8］。

3.2 寿胎丸对自体卵巢移植大鼠E2 分泌的影响

移植术后E2的分泌变化说明将自体卵巢移植到大鼠腹膜后，短时间内即可重建血液循环，移植的卵巢也能恢复内分泌功能。有研究［9］发现:皮下无血管移植，移植物血管重建在移植后的48 h 就开始了。本课题研究发现:自体卵巢移植后第16～25 天、第26～35 天的E2分泌未继续增多，仅维持在一个较高水平，较正常对照组低(P＜0.05)，提示移植卵巢过程中的冻融损伤、缺血缺氧损伤等因素，导致了大部分卵泡丢失，内分泌功能相应减退。有文献［10］报道:卵巢组织在冻融过程中会损失7%的卵泡，但移植后组织的局部缺血性损伤会使移植物损失全部的生长卵泡群，以及显著数量的原始卵泡，新血供重新建立前可能丧失60%以上的原始卵泡，认为卵巢移植后缺血损伤可能限制了自体移植卵巢长期存活。

自体卵巢移植后缺血缺氧损伤是导致卵泡丢失的最主要原因。寿胎丸可能因为不能加速自体卵巢移植后的血管重建，从而在提高自体移植卵巢成活率、促进内分泌功能恢复等方面疗效不明显。

3.3 寿胎丸对异体卵巢移植大鼠E2 分泌的影响

唐丽丽等［2］研究发现，寿胎丸有助于异体卵巢移植术后卵巢的成活，促使移植卵巢恢复内分泌功能。本课题研究发现，卵巢移植术后，异体移植+CsA 组、异体移植+CsA +寿胎丸组的E2水平高于异体移植模型组和异体移植+ 寿胎丸组(P＜0.05)，异体移植+CsA +寿胎丸组的E2水平高于异体移植+CsA 组(P＜0.05)，说明异体卵巢移植大鼠，应用CsA 和寿胎丸抗排斥后，移植卵巢内分泌功能恢复;寿胎丸与CsA 有协同作用，二者联合使用，可更好地逆转移植后的急性排斥反应，促进异体移植卵巢存活;单独应用寿胎丸的抗排斥效果并不理想。妊娠和器官移植部分相似的免疫机制，可能是寿胎丸抗移植排斥反应起作用的基础。

［1］Oktay K，Newton H，Aubard Y，et a1. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue:an emerging technology［J］.Fertil Steril，1998，69(1):1－7.

［2］唐丽丽，罗颂平. 寿胎丸抗大鼠同种异体卵巢移植模型急性排斥反应的研究［J］. 中华中医药学刊，2009，27(10):2098－2101.

［3］周英，叶敦敏. 寿胎丸合失笑散治疗肾虚血瘀型先兆流产的临床疗效观察［J］. 广州中医药大学学报，2006，23(1):25－29.

［4］丁琴音. 寿胎丸加味治疗先兆流产、习惯性流产62 例［J］.江西中医药，1999，30(2):23.

［5］李小娜，张兰桐，殷玮.中药复方药效物质基础研究途径与方法［J］.中草药，2006，37(6):801－805.

［6］曾诚，岳明明. 试论先兆流产的中医证型分布规律［J］.中国中医药信息杂志，2002，9(8):5－8.

［7］丁立，钱江，张颂，等. 寿胎丸的药效学和毒理学研究［J］.中药药理与临床，1997，13(5):5.

［8］罗颂平，梁国珍，张玉珍，等. 助孕3 号方防治大鼠自然流产机理的研究［J］. 中国中西医结合杂志，2003，23(7):522－525.

［9］李云秀，牛晓明，章晓梅，等. 大鼠胚胎卵巢冷冻保存和异体无血管皮下移植的生长［J］. 中国组织工程研究与临床康复，2009，13(5):811－815.

［10］张皓云，管英俊，孙秀宁. 冻存卵巢移植后功能及其影响因素［J］.解剖科学进展，2004，10(4):332－335.