平行试验法优选黄芪总黄酮提取条件

张军武 赵 琦

黄芪为常用补气中药，2010年版中国药典规定黄芪为豆科植物蒙古黄芪［Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］或膜荚黄芪［Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.］的干燥根［1］。黄芪的化学成分复杂［2～4］，包括皂苷类，多糖类，黄酮类以及各种氨基酸、微量元素、生物碱类、有机酸类等。黄酮类化合物是天然抗氧化剂家族中的重要成员之一，它具有很强的清除自由基和抑制脂质过氧化特性。研究显示黄酮类化合物可抑制动脉粥样硬化形成［5］，但是黄芪中黄酮类化合物遇热不稳定，提取温度不宜太高［6］，而且实际生产中以加热回流为主要提取方法。因此，本文采用平行试验法优选回流提取黄芪总黄酮的最佳温度，以期为大生产提供参考。

材料与方法

1.仪器与试药:(1)仪器:UV1102型紫外/可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司生产);FA1004N电子分析天平(上海天平厂生产);ZK－82A型真空干燥箱(上海实验仪器厂生产);GKC－11－CR2型电热恒温水浴锅(上海金桥科析仪器厂生产)。(2)试药:2年生黄芪采集于陕西省旬邑县黄芪GAP基地，经鉴定为蒙古黄芪［Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］;芦丁对照品购自中国药品生物制品检定所(批号:0080－9705);亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇等所用试剂均为分析纯。

2.实验方法:(1)样品制备:称取黄芪粗粉10g，共15份，分别置500ml烧瓶中，加入95%乙醇200ml，摇匀，加热回流1h，放冷至室温，滤过，滤液浓缩至适量，将得到的浓缩液定容至250ml容量瓶中，备用。(2)方法学考察:以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法测定总黄酮的含量。①对照品溶液的制备:精密称取在105～110℃干燥至恒重的芦丁对照品10.5mg，加95%乙醇定容于25ml容量瓶中，得到浓度为0.42mg/ml的溶液作为对照品溶液;②标准曲线的绘制:精密吸取对照品溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml;分别置于 10ml容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.3ml，放置6min;再加10%硝酸铝溶液0.3ml，放置6min;最后加入4%氢氧化钠溶液4ml;分别加95%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，置比色皿中，在510nm波长处测定。以吸光度A为纵坐标，总黄酮含量(μg/ml)为横坐标计算回归方程为:A=0.008940476C+0.3225，相关系数 r=0.9983，线性范围:8.4 ～42.0μg/ml;③供试品溶液的制备:精密吸取上述平行试验的样品溶液1ml，置10ml容量瓶中，照标准曲线下方法操作，测定吸收度，由回归方程求出稀释液中总黄酮浓度;④精密度试验:精密吸取供试品溶液，连续测定5次，记录吸光度，结果RSD为1.74%，表明精密度良好;⑤稳定性试验:精密吸取供试品溶液，分别于10、20、30、40min测定1次，记录吸光度，结果 RSD为1.33%，表明在40min内稳定性良好;⑥重复性试验:精密吸取样品溶液1ml，共5份，分别按供试品溶液制备方法操作，按上述色谱条件测定吸光度并计算含量，结果RSD为1.13%，表明本方法重复性良好;⑦加样回收率试验:精密吸取样品溶液1ml，共5份，分别加适量芦丁对照品，按供试品溶液制备方法进行操作，测定含量，计算回收率。结果表明:回收率在95% ～100%之间，RSD为1.18%，加样回收良好。

结 果

测定结果见表1。由表1测定结果可以看出，60℃和70℃下总黄酮含量比较低，80℃时含量最高，当提取温度高于90℃以上时总黄酮含量有所下降。所以选择80℃提取比较合适。

表1 黄芪总黄酮测定结果

讨 论

从中药中提取天然活性成分的方法很多，但是以溶剂提取法最为常用。溶剂提取法是选择适当溶剂将中药中的化学成分提取出来，如果药材没有特殊性质，则一般选择加热回流提取的方法，以便提高提取效率。对于大部分活性成分来说，提取温度的升高意味着活性的变化或者消失，因此，回流提取必须控制加热温度，以便最大限度地保护活性成分，发挥中药制剂的最大疗效。

黄芪总黄酮是黄芪抗氧化、清除自由基的主要活性成分，也是黄芪的主要活性成分;另外，在大生产过程中黄芪的传统提取方法是加热回流，提取温度很容易升高至100℃;因此在黄芪总黄酮的提取过程中应注意提取温度的控制，以免总黄酮的生物活性受到破坏。

通过查阅相关文献［6，7］，结合生产安全并兼顾提取效率，设计60～100℃ 5个提取温度，采用平行试验法优选出乙醇回流提取黄芪总黄酮的最佳温度。试验证明:乙醇回流提取黄芪总黄酮的最佳温度为80℃。此温度较为符合大生产实际情况，故可以进行扩大试验并推广，从而为有效的提取黄芪总黄酮提供科学依据。

1 中华人民共和国药典委员会.中国药典［S］.1部.北京:中国医药科技出版社，2010:283－284

2 齐宗韶.黄芪化学成分的研究概况［J］.中草药，1987，18(5):41

3 吴继洲.内蒙黄芪化学成分的研究(Ⅰ)［J］.中草药，1982，13(8):3

4 王惠康.内蒙黄芪化学成分的研究(Ⅱ)［J］.中草药，1989，20(5):6

5 汪德清，丁保国，Neil TG，等.黄芪总黄酮对动脉粥样硬化早期形成的影响［J］.中国药理学通报，2003，19(6):637 －640

6 赵海燕，沙瀛，陈洋东.黄芪中皂甙·黄酮和多糖综合利用的工艺研究［J］.安徽农业科学，2009，30(5):2051 －2053

7 孔繁晟，贲永光，孙爱群，等.超声法与连续回流法提取黄芪总黄酮的工艺对比研究［J］.中国药房，2010，21(19):1752－1754