五种蜂花粉醇提物抗氧化能力的比较

蔡文倩，卢佳琨，兰桃芳，王丽媛，孟良玉

（渤海大学食品科学研究院，渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁省食品安全重点实验室，“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”辽宁省高校重大科技平台，辽宁锦州 121013）

蜂花粉是经蜜蜂采集加上蜜蜂自身的腺上分泌物、唾液和花粉形成的花粉球[1]。蜂花粉中含有丰富的营养成分如必需氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质元素、胡萝卜素、多糖等活性物质，因此被誉为“微型营养库”[2-3]。此外，蜂花粉中多酚类和黄酮类物质广泛存在，它们有卓越的抗氧化作用和清除自由基能力，被认为是有效的抗氧化剂。

蜂花粉的种类很多，一般按照植物来源分类。不同花粉之间营养成分和生物学功能均存在一定差别。因此，研究不同种类蜂花粉的抗氧化作用具有重要的应用价值[4-6]。本实验通过测定蜂花粉清除DDPH自由基（DPPH·）、清除羟基自由基（·OH）、清除超氧阴离子自由基（O2-·）、清除亚硝酸盐的能力及还原力对五种蜂花粉进行体外抗氧化活性的比较。为不同种类蜂花粉作为天然抗氧化剂被开发利用提供一定参考。从植物原料中提取的天然抗氧化剂，具有安全、无毒等优点，越来越受到欢迎，天然抗氧化剂的研究也成为一个研究热点[7]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

五种蜂花粉（荷花、绿茶、油菜、玫瑰、茉莉）：锦州人益园养蜂场；二苯代苦味肼基自由基标准品、Tris均为分析纯：Sigma 公司；无水乙醇、FeSO4·7H2O2、水杨酸、H2O2（质量分数30%）、NaNO2、NaOH、Al（NO3）3、无水对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、邻苯三酚、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、VC、BHT、HCl均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

722N紫外可见分光光度计、FA－2004电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；HH恒温水浴锅：城威瑞科教仪器；SZF－06A脂肪测定仪：上海新嘉电子有限公司；TD5A－WS低速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂花粉醇提物的制备

每种蜂花粉各取5 g，以料液比1∶15（g/mL）加入90%乙醇，在80℃下提取2 h，抽滤3次后加热挥发，直至体积为50 mL。采用NaNO2－Al（NO3）3比色法测定提取率，并计算浓度，最后将醇提物、VC、BHT 3种物质用无水乙醇分别配置成 2、4、6、8、10 μg/mL 的溶液。

1.3.2 对DPPH自由基清除能力的测定[8]

精确吸取2 mL不同浓度样品醇提物于试管中，分别加入2 mL 2×10－4moL/mL DPPH溶液，摇匀后置于25℃恒温水浴锅中加热30 min，在517 nm处测定吸光度值Ai。同时测定2 mL不同浓度样品提取液与2 mL无水乙醇混匀后的吸光度值Aj和2 mL DPPH溶液与2 mL无水乙醇混匀后的吸光度值A0。用等质量浓度的VC、BHT代替样品做对照，计算清除率（E）：

1.3.3 对羟基自由基清除能力的测定[9]

精确吸取0.3 mL不同浓度样品醇提物于试管中，依次向试管中加入2 mL 9 mmoL/L FeSO4、2 mL 9 mmoL/L水杨酸、2 mL 8.8 mmoL/L H2O2，用蒸馏水定容至10 mL并摇匀，在37℃下恒温加热30 min后在510 nm处测定其吸光度值Ai；将体系中样品用0.3 mL无水乙醇代替，在相同条件下测定其吸光度值A0；将体系中H2O2用蒸馏水代替在相同条件下测定其吸光度值Aj。用等浓度的VC、BHT代替样品做阳性对照，计算清除率（E）：

1.3.4 对亚硝酸盐清除能力的测定[10]

精确吸取0.2 mL不同浓度样品醇提物于25 mL容量瓶中，然后加入pH为3.0的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲溶液5 mL、5 mg/L亚硝酸钠溶液1.8 mL，摇匀后置于37℃恒温水浴锅中恒温反应1 h，加入2.0 mL 0.4%的对氨基苯磺酸溶液，摇匀后静置5 min再加入0.2%的盐酸萘乙二胺溶液1.0 mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀后静置15min。在540nm处测定其吸光度值A。用等浓度的VC、BHT代替样品做对照，根据下式计算清除率：

式中：A0为未添加提取物NaNO2的吸光度；A为添加提取物后NaNO2的吸光度。

1.3.5 还原力的测定[11]

精确吸取0.2 mL不同质量浓度样品醇提物于试管中，加入2.0 mL pH为6.6的磷酸盐缓冲液（0.2 moL/L）及2.0 mL 1%的铁氰化钾溶液，混匀后置于50℃恒温水浴锅中加热20 min后，向混合液中加入2.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，混匀后以3 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液，混匀后，待室温下反应10 min后，于700 nm处测定吸光度值。吸光度值越大则表示样品还原能力越强，用等质量浓度的VC、BHT代替样品做对照。

1.3.6 对超氧阴离子自由基清除能力的测定[12]

向各容量瓶中加入3mmoL/L邻苯三酚溶液0.3mL，再分别加2 mL不同浓度的样品醇提物，用pH为8.3的Tris－HCl缓冲溶液定容至9 mL，迅速混匀并以蒸馏水作参比，在325 nm处每隔30秒测一次吸光度值，直到反应启动后的第6分钟结束测定，把所得的数据以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标进行线性回归曲线，得到的直线斜率为反应速率ΔA、ΔA0，用等浓度的VC、BHT代替样品做对照。清除率计算公式如下：

式中：ΔA0为邻苯三酚的自氧化法速率；ΔA为加入样液后邻苯三酚自氧化法速率；单位均为吸光度每分钟的增值。

2 结果与分析

2.1 蜂花粉醇提物清除DPPH自由基的能力

在相同条件下，5种蜂花粉不同浓度醇提取物对DPPH自由基的清除能力如图1所示，其对DPPH自由基均有较好的清除效果，且在试验浓度范围内随醇提物浓度的增加而增强。在反应体系中油菜花粉对DPPH自由基的清除能力最强但次于VC，在质量浓度为4 μg/mL处，油菜花粉醇提取物的清除率与VC的清除率最接近（分别为：43.9%、44.3%）。在质量浓度2 μg/mL～4 μg/mL之间，玫瑰花粉醇提取物的清除率先弱于绿茶花粉醇提物，后强于绿茶花粉醇提物的清除率。花粉醇提物、VC、BHT对DPPH自由基清除能力的大小顺序为：VC＞油菜花粉＞玫瑰花粉＞绿茶花粉＞茉莉花粉＞BHT＞荷花花粉。

2.2 蜂花粉醇提物清除羟基自由基的能力

在对羟基自由基清除作用的研究中发现，5种蜂花粉醇提物对其均有较好的清除能力，且随醇提物浓度的增加，清除率呈上升趋势，醇提物与清除率在实验浓度范围内呈正相关，见图2。

5种蜂花粉中油菜蜂花粉的清除率最高。在质量浓度2 μg/mL～6 μg/mL之间玫瑰花粉醇提物的清除率先弱于绿茶花粉醇提物，后强于绿茶花粉醇提物的清除率，且二者的清除率曲线在质量浓度8 μg/mL～10 μg/mL之间的变化趋势一致，在质量浓度为10 μg/mL处，油菜蜂花粉和VC的清除率较接近。总的来说，五种蜂花粉醇提物、VC、BHT对羟基自由基清除能力的大小顺序为：VC＞油菜花粉＞玫瑰花粉＞绿茶花粉＞茉莉花粉＞BHT＞荷花花粉。

2.3 蜂花粉醇提物清除亚硝酸盐的能力

随着蜂花粉醇提物浓度的增加，五种蜂花粉醇提物对亚硝酸盐的清除率呈上升趋势，且清除效果较好，如图3所示。

在质量浓度4 μg/mL～8 μg/mL之间，油菜花粉醇提物的清除率呈直线上升，且其变化趋势与VC一致。在质量浓度为4 μg/mL时，绿茶花粉醇提取物、玫瑰花粉醇提取物、茉莉花粉醇提取物的清除率相接近（清除率分别为：30.6%、30.3%、29.8%）。五种蜂花粉醇提物、VC、BHT对亚硝酸盐的清除能力的大小顺序为：VC＞油菜花粉＞绿茶花粉＞玫瑰花粉＞茉莉花粉＞BHT＞荷花花粉。

2.4 蜂花粉醇提物还原力的测定

通过对5种蜂花粉醇提物还原力测定可以看出，其醇提物均具有较强的还原力，且随着质量浓度的增大，5种蜂花粉醇提物的还原力不断增强，如图4。

油菜花粉醇提物的吸光度值在试验浓度范围内的上升趋势接近直线，其还原效果小于VC强于其它蜂花粉醇提物的还原能力。总的来说，5种蜂花粉醇提物、VC、BHT还原力的大小顺序为：VC＞油菜花粉＞玫瑰花粉＞绿茶花粉＞茉莉花粉＞BHT＞荷花花粉。

2.5 蜂花粉醇提物清除超氧阴离子自由基的能力

超氧阴离子自由基（O2－·）的作用与生物衰老、某些疾病的发病机制密切相关，5种蜂花粉醇提取物对超氧阴离子自由基的清除能力如图5所示。

5种蜂花粉醇提物质量浓度与清除率在实验范围内呈正相关。在5种花粉醇提液中，油菜花粉的醇提物对O2－·的清除能力最强仅次于VC。在质量浓度2 μg/mL处，绿茶花粉醇提取物与茉莉花粉醇提取物清除率（清除率分别为：18.9%、19.2%）相接近，且在质量浓度 4 μg/mL～10 μg/mL 之间时，二者的清除率曲线变化基本一致。实验结果表明超氧阴离子自由基清除能力的大小顺序为：VC＞油菜花粉＞玫瑰花粉＞绿茶花粉＞茉莉花粉＞BHT＞荷花花粉。

3 结论

本试验采用醇提取法，在乙醇浓度为90%、固液比1∶15、提取时间2 h、提取温度80℃的提取条件下提取抗氧化物质，并测定提取率。通过对清除DPPH自由基（DPPH·）、清除羟基自由基（·OH）、清除亚硝酸盐、还原能力、清除超氧阴离子自由基（O2－·）能力的大小进行研究，比较5种蜂花粉醇提物的抗氧化性能，并以VC、BHT作参比对照，得到如下结论，清除DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基以及还原力能力的大小均为：VC＞油菜花粉＞玫瑰花粉＞绿茶花粉＞茉莉花粉＞BHT＞荷花花粉；清除亚硝酸盐能力的大小为：VC＞油菜花粉＞绿茶花粉＞玫瑰花粉＞茉莉花粉＞BHT＞荷花花粉。5种蜂花粉醇提物的抗氧化性如下：油菜花粉醇提物的抗氧化性最好（但小于VC）；荷花花粉醇提物抗氧化效果最差；玫瑰、茉莉、绿茶花粉醇提物三者的抗氧化效果依次降低，但都大于BHT。

油菜、绿茶、玫瑰、茉莉、荷花五种蜂花粉醇提物体外都具有一定的抗氧化性能，因此在天然抗氧化剂和功能食品的开发方面均显示出良好的前景。

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