茶叶多糖的纯化工艺

王黎明，夏文水

（1.无锡商业职业技术学院，江苏无锡 214153；2.江南大学，江苏无锡 214036）

近年，茶多糖因具有较多的生理保健功能，引起了很多研究者的兴趣，特别是从粗老茶中提取茶多糖，既可以开发保健食品，也可以综合利用资源，成本低、价值高。但是茶多糖的提取纯化过程中，初步纯化工艺是个较难处理的工艺过程。如果方法选择得当，纯化效果好，速度快，成本低；反之，则效果差，速度慢，成本高。虽然纯步纯化工艺已有许多报道，但多数是就某个方面的纯化工艺。倪德江等报道，Sevag法脱蛋白的效果主要在前三次，不同茶类，蛋白质的去除率不同[1]。陈海霞等则用聚酰胺吸附法脱除茶多糖中水溶性色素[2]。也有很多报道用氧化法，即用H2O2作氧化剂将色素氧化成无色物质。黄桂宽等用40%和60%的乙醇分级沉淀茶多糖，干燥后分别得浅黄色和灰白色两种多糖TP－1和TP－2，得率分别为2.8%和0.7%，总糖含量分别为48.24%和57.71%，其中TP－1为中性杂多糖[3]。杨其林用CTAB沉淀茶多糖，得率为1.34%[4]。陈海霞等分别用醇沉淀法、超滤法和CTAB沉淀法制备了茶多糖粗提物[5]。汪东风等将粗多糖过Sephadex G200柱，0.1 mol/L NaCl溶液洗脱，得茶多糖纯化物[6]。王丁刚等也将茶多糖粗品过 Sephadex G200，用0.1 mol/L NaCl溶液洗脱，得到纯化的茶多糖[7]。严明潮等研究发现超滤膜的材料会直接影响茶多糖的含量和得率，研究认为选择在50℃下浸提45 min，选用截留相对分子质量为8万～10万的聚砜膜在50℃、0.2 MPa下分离是比较理想的[8]。

本文将对茶多糖的初步纯化工艺作较为详细、系统的研究，侧重于实用和低成本。

1 材料与方法

1.1 材料

五级绿茶由无锡翠竹茶叶有限公司馈赠，所有试剂均为国产试剂。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理及茶多糖提取方法

[8]。

1.2.2 粗多糖相对分子质量分布的测定

高效凝胶过滤色谱法，色谱柱：UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mmid×2；流动相：0.1M NaNO3；流速：0.9 mL/min；柱温：45 ℃；多糖标样：Dextran T－2000，Dextran T－500，Dextran T－70，Dextran T－40，Dextran T－10，Dextran T－5；分子量线性方程：Log Mol Wt=13.0－0.461T（r=0.997）。

1.2.3 Sevag法脱蛋白

茶多糖溶液中加入1/3体积的Sevag试剂（氯仿：正丁醇=4∶1），室温下磁力搅拌 30 min，静置 2 h，分离除去白色乳浊液。取少许多糖溶液，并稀释至合适的浓度，苯酚－硫酸法测定多糖和考马斯亮兰法[9]测定蛋白质含量。

1.2.4 树脂和聚酰胺的预处理

大孔吸附树脂在乙醇中充分浸泡后，用乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊，再用去离子水洗净乙醇，加5%HCl溶液浸泡3 h，去离子水洗至中性，加5%NaOH浸泡3 h，去离子水洗至中性，备用。聚酰胺用水充分溶胀后，依次用5%HCl和5%NaOH洗涤，方法同上。

1.2.5 脱色材料的筛选

取预处理过的聚酰胺和大孔吸附树脂各10 mL，加入20 mg/mL茶多糖溶液20 mL，搅拌过夜，充分静置，过滤，380 nm测定吸光度[10]，计算脱色率。并测定多糖和蛋白质含量，计算多糖保留率和蛋白去除率。

1.2.6 聚酰胺动态脱色

取预处理过的聚酰胺，装柱（2.6 cm×80 cm），使用前用50%甲醇水溶液洗涤2个柱体积，再用去离子水平衡。茶多糖配制成20 mg/mL溶液，上柱，去离子水洗脱（28 mL/h）1个柱体积后改用0～70%乙醇梯度洗脱。380 nm测定洗脱液吸光值，计算脱色率。苯酚－硫酸法检测多糖，计算多糖保留率。

1.2.7 Sephadex G50脱色

样品上Sephadex G50（1.6×100 cm）。上样量：柱体积的 5%；洗脱液：0.1 M NaCl，流速：12 mL/h，380 nm检测洗脱液吸光值，硫酸－苯酚法检测多糖，收集多糖组分。

1.2.8 脱色率

1.2.9 多糖纯化倍数

1.2.10 多糖保留率

1.2.11 蛋白去除率

2 结果与分析

2.1 粗多糖的得率及其分子量分布

茶多糖提取液中加入乙醇浓度为94%的工业酒精至乙醇浓度为70%，室温过夜，离心，沉淀进行冷冻干燥，得率为3.2%，高于资料报道的2.97%的最高提取率，纯度为47%。测定粗多糖的分子量分布，其主峰的相对分子质量为11 291，峰3的相对分子质量为451，说明茶多糖提取液中小分子杂质较多（图1）。

2.2 粗多糖脱游离蛋白

常用的脱蛋白方法有Sevag法[11－12]、三氟三氯乙烷法[13]、三氯乙酸法[14－15]。茶多糖提取液中加入不同量的三氯乙酸（4℃环璄中），发现茶多糖溶液的颜色由淡黄色变为红褐色，没有白色沉淀形成。加入乙醇至70%浓度，静置过夜，也没有形成絮状沉淀，用截留分子量为5000的透析袋透析48 h，检测袋内溶液，发现袋内多糖含量极低，表明茶多糖被三氯乙酸降解，因此不宜用三氯乙酸脱除茶多糖中的杂蛋白，因而改用Sevag法，效果如图2。

从图2可以看出，用Sevag法除茶多糖中的游离蛋白，第1次效果最好，蛋白脱除量大，多糖损失小；3次以后，蛋白含量的变化很小，而多糖损失却很严重，因此用Sevag法除茶多糖蛋白，重复3次即可。重复3次，茶多糖的总蛋白去除率约为28%，由原来的15%下降到了11%。

2.3 茶多糖脱色

2.3.1 脱色材料的筛选

茶色素是黄酮类和多酚类的氧化聚合物的异质类群，由茶红素和茶褐素组成。茶红素是主体，占茶色素总量的85%以上，以儿茶素二聚物和低聚物为主，茶褐素以儿茶素高聚物为主，占茶色素的10%～15%[16]。一般小分子量的茶红素易溶于水，而大分子量的茶褐素易溶于醇。

乙醇沉淀多糖，可除去部分水溶性色素，但仍有大量醇溶性色素不能去除，需采用其它方法去除。常用的脱色方法中，金属络合法具有很强的选择性，而氧化法是用H2O2将茶色素氧化为无色物质，未真正去除色素物质，因此这两种方法均不宜采用。由于茶色素的酚羟基和多糖的醇羟基均可与碱性阴离子交换树脂发生离子交换作用而形成牢固的作用力，需用高浓度的盐和碱才能洗脱，而茶多糖在碱性条件下不稳定，因此需选用作用力较弱的吸附作用或氢键作用进行脱色。常用于脱色的作用力较弱的吸附剂有活性碳、硅藻土和吸附树脂等，而聚酰胺常用于多酚类和黄酮类的分离[17]。活性碳和硅藻土通过表面作用将介质中直径小于其孔径的杂质吸附到孔隙中，而茶色素的相对分子质量分布较广，因此该方法也不能完全去除茶多糖中色素。

大孔吸附树脂和聚酰胺既具有表面吸附作用，又有氢键作用，是近代发展起来的一类有机高聚物吸附剂，其中 DM130、S8、HPD500、HZ801、AB8 、NKA2 是对黄酮和多酚类化合物有较好分离效果的大孔吸附树脂。表1表明以上材料脱色率由大到小依次为：聚酰胺＞DM130＞S8＞HPD500＞HZ801＞AB8＞NKA2；多糖的保留率依次为：S8＞DM130＞聚酰胺＞HPD500＞AB8＞NKA2＞HZ801。从表中还可以看到，聚酰胺和大孔吸附树脂都有一定的脱蛋白效果，其中聚酰胺对蛋白的去除率最高，约为26%，各种大孔吸附树脂对蛋白的去除率相近，均在20%左右。虽然S8对多糖的保留率比聚酰胺高，但蛋白去除率和脱色率都不如聚酰胺高，因此宜选用聚酰胺脱色。

表1 聚酰胺和大孔吸附树脂静态脱色效果Table 1 Decolor effects of polyamide and macropore adsorptive

2.3.2 聚酰胺柱动态脱色效果

聚酰胺分子中存在众多酰胺键，可与酚类、酸类、醌类、黄酮类等多种化合物形成氢键而吸附，在水中形成氢键的能力强，吸附强，在有机溶剂中则较弱，在酸性溶剂中强，碱性溶剂中最弱。利用上述性质可采用不同溶剂吸附，不同极性或pH的溶剂洗脱，即可达到脱色目的。由于茶多糖在碱性条件下不稳定，所以宜用去离子水先将不吸附组分洗脱，再用有机溶剂将各组分按氢键作用力由弱到强的顺序梯度洗脱。常用的有机溶剂为乙醇。

去离子水可将大部分多糖与色素分离，但仍有部分多糖与聚酰胺结合紧密，需用高浓度乙醇将其洗脱。收集多糖含量较高的洗脱峰（图3），真空浓缩的同时去除乙醇，冷冻干燥，得TPS1和TPS2。TPS1约回收了总多糖的60.3%，其纯度由Sevag法脱蛋白后的49.8%提高到了70.2%，超过大多数市售茶多糖产品60%左右的纯度，纯化倍数为1.49。颜色由原来的深红色变为淡黄色，TPS2约回收了总多糖的28%，仍含有大量色素。

实验过程中还发现，将粗多糖配制成高浓度水溶液，室温下放置3 d～4 d，产生了大量白色沉淀，测定结果表明该沉淀主要为蛋白质。推测是因为多糖干燥时，蛋白质和胶质等杂质发生了变性固化，当用水再次溶解，变性的蛋白质难以在水溶液中稳定存在。用该法先除去部分蛋白，再上聚酰胺柱脱色的同时脱蛋白，取得了良好的脱蛋白效果。

2.3.3 TPS1进一步脱色

李布青等将脱蛋白后的茶多糖用DEAE－纤维素柱分离，0.1 mol/L NaOH洗脱，获得较纯的茶多糖。许新德等也将粗老绿茶过DEAE－纤维素柱，得一中性多糖和3个酸性多糖[17]。但是本人在研究过程中也发现，用DEAE－纤维素柱分离脱蛋白后的茶多糖时，不仅大量色素被吸附在柱材料上，茶多糖也被大量吸附在柱材料上，用2.0 mol/L的NaCl溶液洗脱，仍不能将茶多糖大部分洗脱下来。洗脱下来的茶多糖脱盐耗时也非常长。因此选用了Sephadex G50柱进一步纯化茶多糖。

Sephadex G50分离多糖的相对分子量范围为500～10 000，而所提取的茶多糖相对分子质量主要集中10 000左右，大部分能全排阻洗脱。图4也表明茶多糖大部分多糖能全排阻洗脱，但仍有约10%的多糖难以与色素分离，推测这部分多糖可能与部分色素呈结合态。收集全排阻峰，用截留分子量为3 000的透析袋透析，冷冻干燥，得白色的TPS1－1。脱色率约为58%，蛋白去除率约为25%，多糖保留率约为88%，多糖的纯度由70%提高到了89%，蛋白质含量由6.1%下降到4.5%。

3 结论

采用Sevag法脱蛋白、聚酰胺柱脱色、以及Sephadex G50进一步脱色的各步脱色率、纯化倍数、纯度、脱蛋白率和蛋白含量见表2。

从表2中可以看出，将含有蛋白和色素的粗多糖用Sevag法脱蛋白，3次可使蛋白含量由15%降低至11%，再经聚酰胺柱动态脱色，多糖纯度大幅度提高，经Sephadex G50柱进一步脱色后，即可得到纯度较高的多糖。因此，茶多糖的初步纯化工艺可采用：Sevag法脱蛋白→聚酰胺柱脱色→SephadexG50进一步脱色。

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