蒲公英总黄酮对假单胞菌抑菌机理的探讨

王晓英

（吉林工商学院食品工程分院，吉林长春 130062）

蒲公英（Taraxacum mongolicumHand-Mazz）是一种常见的药食两用植物，具有广谱的抑菌作用，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒都有不同的抑制作用，蒲公英黄酮类提取物和其中的芦丁有较强的体外清除超氧阴离子的能力[1]，蒲公英对金黄色葡萄球菌耐药菌株、溶血性链球菌及肺类双球菌、脑膜炎球菌、白喉杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌等均有一定的杀菌作用[2]，而且蒲公英野生资源极为丰富。

本文以冷鲜肉中典型的革兰氏阴性腐败菌假单胞菌为检测对象，通过测定蒲公英总黄酮类提取物与假单胞菌作用前后细菌培养液的电导率、可溶性糖类及蛋白质表达方面的变化，较全面地考查蒲公英黄酮类提取物对假单胞菌体细胞膜和细胞内分子代谢的影响作用，为蒲公英总黄酮类提取物用于冷鲜肉的涂膜保鲜提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

UV-7502PC紫外可见分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司；YXQ-LS-18SI手提式高压灭菌锅：上海涵今仪器仪表有限公司；HPX-9052A电热恒温培养箱：北京中科浩宇科技发展有限公司；BANTE950型精密电导仪：上海理达仪器厂；318C酶标仪：上海精科分析仪器厂。

1.2 材料

1.2.1 原料

蒲公英：采自吉林省长春市双阳区田间的野生蒲公英，采集时间，2011年9月。

1.2.2 供试菌种

假单胞菌：由吉林工商学院食品工程分院微生物实验室保存。

1.2.3 培养基

琼脂培养基：蛋白胨20g，蒸馏水1L，氧化镁1.4g，硫酸钾 1.0 g，琼脂 13.6 g，甘油 10 mL，pH7.2，121 ℃灭菌15 min。28℃条件下48 h。

1.3 蒲公英抑菌成分的提取

采用水提法，二级浸提的方式。将干燥后的蒲公英全草，经过粉碎机粉碎，加入20倍量的水，80℃水浴回流浸提30 min。重复提取2次，用4层纱布过滤，合并提取液。按此工艺得到的蒲公英中的总黄酮提取物总量分别为：1.51 g/L。总黄酮类含量的测定方法采用李立顺等[3]的方法。

1.4 蒲公英总黄酮类提取物对假单胞菌的抑菌试验（K-B纸片扩散法）

将假单胞菌在培养基上活化后，用灭菌生理盐水配成含菌数106cfu/mL～107cfu/mL的菌悬液备用。一般挑取纯化的大小适中的菌落2个，无菌操作，加入9 mL生理盐水中，搅拌均匀。将厚度为1.5 mm的滤纸用打孔器制成直径为6 mm的滤纸片，放入培养皿中，121℃高压灭菌30 min，然后在100℃烘干，备用。将配制好的灭菌培养基冷却至50℃～60℃，倾注于干热灭菌培养皿内，制成平板[4]。用无菌移液管分别吸取0.1 mL供试菌悬液于固体培养基平板中，用无菌三角玻璃涂棒，将菌悬液在琼脂培养基上均匀涂布。将滤纸片置于不同浓度的蒲公英总黄酮类提取物稀释液中，浸泡30 min，取出，30℃烘干制成药敏纸片，备用。把制备好的药敏纸片等距离放入含菌平板内压实，每个平板放4个药敏片，4℃作用2 h后，将平板倒置放入培养箱中，37℃培养18 h～24 h，测量各药敏片的抑菌环直径大小[6]。以蒸馏水作为空白对照。

1.5 蒲公英总黄酮类提取物对假单胞菌最小抑菌浓度（MIC）的测定

按1.4所示方法制备假单胞菌菌悬液。将蒲公英总黄酮类提取物用无菌蒸馏水稀释成不同浓度的受试液，使其浓度分别为：1.5、0.75、0.375、0.187 5、0.093 75 mg/mL。取各稀释度受试液加入到琼脂培养基中，取0.1 mL含菌量为106cfu/mL～107cfu/mL试验菌悬液接种于含蒲公英提取液的琼脂培养基中作为试验样本，另设蒸馏水做阳性对照样本，将试验组样本、阳性对照组样本放置于37℃培养箱中，培养48 h，观察结果。

1.6 蒲公英总黄酮类提取物对假单胞菌的抑菌机理的研究

1.6.1 蒲公英总黄酮类提取物对假单胞菌细胞膜通透性的影响

活化假单胞菌，28℃振荡培养，菌液浓度调到106cfu/mL～107cfu/mL，取适量菌液，加入蒲公英提取液使其最终总黄酮浓度为0.75 mg/mL，用无菌水代替蒲公英提取液作对照组，每隔10 min测一次培养菌液的电导率，平行实验三次，以确定金属离子的渗出的变化趋势。

1.6.2 蒲公英总黄酮类提取物对培养液中蛋白质浓度的影响

活化假单胞菌，28℃振荡培养，菌液浓度调到106cfu/mL～107cfu/mL，取适量菌液，加入蒲公英提取液使其最终总黄酮类提取物的浓度为0.75 mg/mL，用无菌水代替蒲公英提取液作对照组，每隔1 h测定培养菌液中蛋白质含量（Bradford法）[4]。

1.6.3 蒲公英总黄酮类提取物对培养液中总糖的影响

活化假单胞菌，28℃振荡培养，取适量菌液，加入蒲公英提取液使其最终总黄酮类提取物的浓度为0.75 mg/mL，分别在 0、1、2、4、6、8、10、12 h 取 1 mL 混合液离心（11 000 r/min，2 min），取上清液稀释5倍后，取50 μL置离心管中，加入200 μL蒽酮试剂，迅速置冰浴中，冷却5 min，再置沸水浴中准确煮沸10 min，通过酶标仪测其在620 nm处吸光度，以标准葡萄糖溶液作标准曲线，用无菌水代替蒲公英提取液作空白对照组，平等实验三次[5]。

2 结果与讨论

2.1 蒲公英总黄酮类提取物对假单胞菌的抑菌效果

蒲公英总黄酮类提取物对假单胞菌的抑菌效果见表1。

蒲公英总黄酮类提取物对假单胞菌有显著的抑菌效果，而且随着蒲公英提取液中总黄酮类提取物的浓度的增加抑菌效果明显增强。

表1 不同浓度的蒲公英总黄酮类提取物对假单胞菌的抑菌效果Table 1 The antimicrobial effect of extractions of total flavonoids from Taraxacum mongolicum Hand-Mazz against pseudomonad for different concentration

2.2 蒲公英总黄酮类提取物对假单胞菌最小抑菌浓度

不同浓度的蒲公英总黄酮类提取物对假单胞菌的最小抑菌浓度见表2。

表2 不同浓度蒲公英总黄酮类提取物最小抑菌浓度试验Table 2 The experiments on the minimal antimicrobial concentration of total flavonoids in Taraxacum mongolicum Hand-Mazz extract with different concentration

由表2可知蒲公英总黄酮类提取物对假单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）为总黄酮类含量3.125×10－2mg/mL。

2.3 蒲公英总黄酮类提取物对假单胞菌抑菌机理的研究

2.3.1 蒲公英总黄酮类提取物对假单胞菌细胞膜通透性的影响

表3显示了经蒲公英提取液处理不同时间后，假单胞菌菌液的电导率的测定结果。

表3 蒲公英总黄酮类提取液处理后假单胞菌菌液的电导率变化Table 3 Changes in electric conductivity of broth for Pseudomonad treated by of total flavonoids from Taraxacum mongolicum Hand-Mazz

由表3可知，经蒲公英提取液处理的假单胞菌的培养液的电导率明显高于对照组，而且随着作用时间的延长，培养液的电导率持续增加，说明当细菌遇到抑菌剂而使细胞膜遭到破坏时，菌体的细胞膜屏障打破，导致其电解质外泄至培养液中，进而使培养液的电导率上升。

2.3.2 蒲公英总黄酮类提取物对培养液中蛋白质浓度的影响

蒲公英总黄酮类提取物对培养液中蛋白质浓度的影响见表4。由表4可知，蒲公英提取液对假单胞菌的细胞膜渗透压影响显著，添加蒲公英提取液6 h后的假单胞菌培养液中蛋白质浓度：242.62 μg/mL，对照培养液中蛋白质浓度：51.12 μg/mL。其主要原因是由于蒲公英提取液中的总黄酮类物质可以改变细菌细胞膜的通透性，导致蛋白质渗透到菌体外的培养液中。

表4 蒲公英总黄酮类提取液处理后假单胞菌菌液蛋白质浓度变化Table 4 Changes in total proteins concentration of broth for Pseudomonad treated by of total flavonoids from Taraxacum mongolicum Hand-Mazz

2.3.3 蒲公英总黄酮类提取物对培养液中总糖的影响蒲公英总黄酮类提取物对培养液中总糖的影响见表5。可知，当假单胞菌与蒲公英提取液（总黄酮类提取物浓度为0.75 mg/mL）作用后，随着作用时间的延长，培养液中总糖的浓度逐渐上升，说明细菌的细胞膜结构受到破坏，细胞内的糖类物质渐渐渗透至细胞外。由于细菌在正常增殖过程中需要利用培养基中的糖类物质，因而对照组培养液中总糖浓度呈下降趋势。3 结论

表5 蒲公英总英酮类提取液处理后假单胞菌菌液中总糖浓度变化Table 5 Changes in total sugar concentration of broth for Pseudomonad treated by of total flavonoids from Taraxacum mongolicum Hand-Mazz

蒲公英提取液中总黄酮类提取物含量为3.125×10-2mg/mL时，能抑制假单胞菌的生长，而且随着蒲公英提取液中总黄酮提取物浓度增大抑菌效果逐渐增强。用总黄酮类提取物浓度为0.75 mg/mL的蒲公英提取液处理假单胞菌菌液时，会加速破坏细胞膜的完整性，导致金属离子、蛋白质和糖类物质的渗出，使细胞代谢率乱，最终使细胞死亡，从而起到抑菌作用。

蒲公英分布广泛，野生资源极为丰富，价格低廉，毒副作用小，具有广谱抗菌作用，因此，蒲公英是理想的天然食品防腐剂[7]。以蒲公英为原料提取天然冷鲜肉的保鲜剂市场前景广阔。

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[1]陈景耀,龚祝南,宰学明,等.蒲公英提取物黄酮类物质成分及其抗氧化活性的初步研究[J].中国野生植物资源,2001,20(3):22-23

[2]陆海峰,罗建华,蒙春越,等.蒲公英黄酮提取及对羟自由基清除作用[J].广州化工,2009,37(3):101-103

[3]李立顺,时维静,关鸣,等.四倍体蒲公英活性成分比较及体外抑菌作用研究[J].中国实验方剂学杂志,2008,14(6):55-58

[4]孙京新,王文娟.茶多酚对假单胞菌抑制机理的研究[J].肉类工业,2010(1):36-39

[5]钱丽红,陶研,谢晶.茶多酚对金黄葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌机制[J].微生物学通报,2010,37(11):1628-1633

[6]宋毓民.蒲公英抑菌成分的分离与鉴定[D].陕西:西北农林科技大学,2006:21

[7]钟振声,黄景怡.蒲公英等五种常见中草药的抑菌研究[J].现代食品科技,2007,23(6):15-16