脐带间充质干细胞染色体核型制备及安全评估

张立新，陈亚宝，叶 军，李 林，林 梅，黄俊星，吴正东

(南通大学医学院附属泰州市人民医院临床医学研究室1、肿瘤科2，江苏 泰州 225300)

脐带间充质干细胞染色体核型制备及安全评估

张立新1，陈亚宝1，叶 军1，李 林1，林 梅1，黄俊星2，吴正东2

(南通大学医学院附属泰州市人民医院临床医学研究室1、肿瘤科2，江苏 泰州 225300)

目的 探讨脐带间充质干细胞染色体核型制备方法，评估脐带间充质干细胞安全性。方法对培养至第2、5、8、10、11代的共15例脐带间充质干细胞进行染色体制备，检查其有无异常。结果成功制备染色体标本，成功率为100%，正常核型率为100%。结论该脐带间充质干细胞染色体制备方法实验结果稳定、成功率高。脐带间充质干细胞在培养至11代时未见异常染色体核型。

脐带间充质干细胞；染色体制备;培养

干细胞是具有自我更新能力且在适宜微环境下具有多向分化潜能的原始细胞。人类间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)可分化形成三个胚层的终末分化细胞，故被称为“各种组织的种子细胞”，且MSC的应用避免了胚胎干细胞所带来的伦理问题，故MSCs是目前干细胞研究中的一个重要环节。MSCs常见来源于脂肪[1]、骨髓[2]、脐血[3]，最近，关于脐带间充质干细胞的分离培养[4]、治疗应用[5-6]的研究逐渐增多。然而，有研究报道骨髓间充质干细胞在体外培养后，染色体易变性增高，并提示干细胞移植存在致瘤风险[2]，因此，间充质干细胞制品均需监测其染色体核型异常可能[3，7]，另外，由于脐带间充质干细胞可能因胎儿遗传学异常，存在异常染色体核型，所以，染色体核型检查对于脐带间充质干细胞更为重要。笔者发现各种间质干细胞染色体制备方法中条件各有不同[8-9]，而脐带间充质干细胞染色体的制备方法报道很少。本实验室在脐带间充质干细胞染色体检查中积累了一些成功经验，在此做一总结，以供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 三份脐带间充质干细胞培养物，由江苏北科生物科技有限公司提供。培养至11代，选择其中的第2、5、8、10、11代共15次标本进行染色体制备检查。

1.2 仪器和试剂 CO2培养箱为美国Thermo公司产品。0.25%EDTA胰酶为美国GIBCO公司出品。秋水仙素制剂由青岛莱佛生物工程研究所提供。贴壁培养瓶为Nunclon公司出品。

1.3 方法 每瓶中含有脐带间充质干细胞1× 106个细胞/10 ml培养液，5%CO2，37℃培养2 d，细胞呈多角形，相互连接，基本占瓶底50%～70%(见图1)，加入秋水仙素至0.3 μg/ml，5%CO2培养3 h后，用吸管吸去瓶中液体，加入EDTA胰酶2 ml，摇匀，静置10～15 min，轻轻拍打瓶底，倒置显微镜下可见细胞呈圆形，悬浮，则加入生理盐水10 ml混匀后，吸出加入15 ml锥底管中，离心10 min；吸除上清液，加入预温至37℃的0.075M KCl溶液12 ml，在37℃温箱中静置34 min；向管中加新鲜1:3醋酸、甲醇固定液3 ml，用吸管吹打调匀，离心10 min，吸除上清液，加固定液10 ml，吹打混匀，静置30 min，固定重复3次；最后，离心吸去上清液，0.5 ml固定液重悬细胞。4℃保存，次日进行染色体显带(R带)，分析20个分裂相。

图1 脐带间质干细胞贴壁生长

2 结果

16份脐带间充质干细胞培养物染色体检查均获得满意的染色体分裂相，脐带间充质干细胞分裂相形态规整，染色清晰(图2)，染色体核型排列见图3。成功率为100%，正常核型率为100%。

图2 分裂相

图3 核型排列图

3 讨论

脐带间充质干细胞在合适的培养基中生长旺盛，一般3 d即可长满，达到分瓶传代要求，而培养第二天时细胞生长较为宽松，且细胞数亦较多，因此，选择42～48 h加入秋水仙素，阻滞其分裂相停滞于中期，所得染色体分裂相分散良好；而0.3 μg/ml的秋水仙素终浓度，5%CO2培养3 h，被证实为分裂相较多，染色体长短适宜，易于分析。另外，CO2培养箱温度波动一定要维持稳定，否则细胞生长不良，分裂相质量较差。EDTA胰酶消化后，应及时拍打，在镜下观察细胞形态，确保细胞均已从瓶底脱落，如仍有少量细胞贴在瓶底，可用吸管吹打至脱落。预固定时加入固定液3 ml，浓度略高，以免离心导致细胞破裂，染色体丢失。最后所制标本4℃过夜，有利于染色体分散。

由于MSCs移植可能存在致瘤风险[2]，而肿瘤的发生与细胞染色体互易、缺失、插入和倒位等为核型的异常改变关系密切[10]，因此，在美国食品药品管理局(FDA)关于MSCs的应用程序中安全性评估提出了对MSCs染色体核型检测的要求，同时，核型分析的异常结果比癌基因的表达特异性更高，因此在细胞治疗资格认证中进行核型分析非常重要。

笔者在脐带间充质干细胞染色体的制备、分析的过程中取得了满意效果，同时，本研究显示脐带间充质干细胞在培养至11代时未见异常染色体核型，此结果可以作为脐带间充质干细胞应用安全的重要证据。

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[3]Huang JL,Yang SX.Safety of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells(MSCs)following 5-azaserine induction and inhibition of human cardiac myocyte apoptosis by MSCs[J].Saudi Med J,2009,30(9):1144-1149.

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[8]陈光平,罗盛康,徐 翔,等.人脂肪干细胞体外增殖的安全性评价[J].广东医学院学报,2009,27(2):126-129.

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Preparation and safety assessment of the chromosome karyotype of umbilical mesenchymal stem cells.

ZHANG Li-xin1,CHEN Ya-bao1,YE Jun1,LI Lin1,LIN Mei1,HUANG Jun-xing2,WU Zheng-dong2.
Department of Clinical Medicine Laboratory1,Department of Oncology,People's Hospital of Taizhou City Affiliated to the Medical College of Nantong University,Taizhou 225300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate methods for preparing chromosome karyotype of umbilical mesenchymal stem cells,and to evaluate the safeness.MethodsThe chromosomes of umbilical mesenchymal stem cell cultured for 2,5,8,10,11 generations were prepared and analyzed.ResultsThe chromosome karyotype of umbilical mesenchymal stem cell were prepared successfully,with a success rate of 100%.The rate of normal karyotype was 100%.ConclusionThe preparation method is effective and stable,with high success rate.No abnormality was found until the 11thgeneration.

Umbilical mesenchymal stem cell;Chromosome preparation;Cultivation

R392.12

A

1003—6350(2012)13—011—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.13.005

2012-02-06)

张立新(1974—)，男，江苏省泰州市人，副主任技师，学士。