PTCL石蜡组织中HTLV-I感染情况的初步研究

凡琳琳，谈 顺*，饶 翔，张英爱，王识华

(中南大学湘雅海口医院病理科1、中心实验室2，海南 海口 570208；海南省农垦三亚医院病理科3，海南 三亚 572000)

·论 著·

PTCL石蜡组织中HTLV-I感染情况的初步研究

凡琳琳1，谈 顺1*，饶 翔1，张英爱2，王识华3

(中南大学湘雅海口医院病理科1、中心实验室2，海南 海口 570208；海南省农垦三亚医院病理科3，海南 三亚 572000)

目的检测外周T细胞淋巴瘤石蜡包埋组织中HTLV-1感染情况以了解外周T细胞淋巴瘤(PTCL)各类型与人类T细胞淋巴瘤病毒Ⅰ型(HTLV-1)的关系。方法根据2008年WHO分类法对46例外周T细胞淋巴瘤进行分类，提取外周T细胞淋巴瘤石蜡组织中人基因组DNA，用PCR方法检测HTLV-1前病毒。结果收集到的46例外周T细胞淋巴瘤石蜡组织中HTLV-1阳性8例，其中HTLV-1在外周T细胞淋巴瘤，非特殊型(PTCL-U)、NK/T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、成人T细胞淋巴瘤中(ATLL)中HTLV-1的检出率分别为15%、8%、10%、75%。结论外周T细胞淋巴瘤存在HTLV-1感染，HTLV-1除与ATLL有密切关系外，与其他类型外周T细胞淋巴瘤也有一定关系。

外周T细胞淋巴瘤；HTLV-1；石蜡包埋组织

外周T细胞淋巴瘤(Peripheral T cell lymphoma，PTCL)是起源于成熟细胞或称胸腺后细胞的恶性肿瘤。广义上的PTCL包括除T细胞淋巴母细胞淋巴瘤/白血病以外的所有T/NK细胞淋巴瘤。外周T细胞淋巴瘤是一组具有很强异质性的疾病的总和，其病因尚不清楚，研究发现与免疫缺陷、病毒感染、基因突变等有关。近年来人类T细胞淋巴瘤病毒1(Human T cell lymphotropic virus type 1，HTLV-1)与外周T细胞淋巴瘤的发生发展的关系备受关注，国内外学者几乎都以患者血液样本作为实验材料，罕见应用石蜡包埋瘤组织进行研究，为进一步探讨外周T细胞淋巴瘤与HTLV-1之间的关系，我们将收集到的经石蜡包埋的46例外周T细胞淋巴瘤依据2008年WHO分类标准[1]进行分类，并运用PCR方法检测。

1 材料与方法

1.1 材料来源 收集海口市人民医院、海南医学院附属医院及农垦三亚医院病理科自1995-2010年诊断为外周T细胞淋巴瘤的石蜡组织，经高年资医师阅片并结合免疫组织化学结果最终筛选出外周T细胞淋巴瘤46例，并依据2008年WHO最新分类对所筛选出的外周T细胞淋巴瘤进行分类，HTLV-1阳性的人基因组DNA(厦门大学熊君辉博士提供)作为阳性对照，淋巴结反应性增生石蜡组织作为阴性对照，PCR试剂盒(天根生化科技有限公司)，PCR引物合成按参考文献[2]扩增产物为326 bp(见表1)由生工生物(上海)有限公司合成。

表1 两对特异性引物

1.2 方法

1.2.1HTLV-1 DNA抽提 石蜡组织DNA抽提参照文献[3]，每例标本在HE切片对照下，选取病变区域，以消毒刀片挑取约6 mm×3 mm×0.5 mm大小的石蜡组织块一片，小心置于0.2 ml PCR管中，并加入1×PCR缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L KCl，pH 9.0)50 μl，以加样枪头碎裂组织片。100℃加热15 min，13 200 r/min离心5 min，吸取蜡层与组织片之间的澄清液作为DNA粗提产物作模板。

1.2.2HTLV-1前病毒DNA的PCR法检测 DNA粗提产物8 μl、10×Taq buffer 5 μl、dNTP混合物(2.5 mmol)4 μl、两种引物各10 μmol/ml、Taq酶(2.5 U/μl)0.5 μl，加水补至50 μl，混匀，石蜡油覆盖。反应条件为：94℃预变性10 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，35个循环；72℃后延伸7 min。

1.2.3 PCR产物纯化、克隆及测序 取10 μl扩增产物加6×2 μl上样缓冲液于1.2%琼脂糖凝胶上电泳(120 V，30 min)，对照标志物无误后，切下特异性条带，用胶回收试剂盒(天根)回收纯化扩增产物，克隆入PGM-T载体(天根)，转化大肠杆菌Top菌株。并由本实验室进行双向序列测定。

2 结 果

依据2008年WHO分类，我们所收集到得46例T细胞淋巴瘤具体分类见表2，PCR检测46例外周T细胞淋巴瘤中HTLV-1阳性8例(占17.39%)，不同类型的外周T细胞淋巴瘤中HTLV-1的检出率不同，在外周T细胞淋巴瘤非特殊型(PTCL-U)、NK/T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、成人T细胞淋巴瘤中(ATLL)中HTLV-1的检出率分别为15%、、10%、75%。

表2 外周T细胞淋巴瘤中HTLV-1的检测(n=46)

用部分PCR产物1.2%琼脂糖凝胶电泳结果见图1，在326 bp处有一条清晰的条带，与阳性对照一致。回收PCR产物，克隆入T载体并测序后证实是HTLV-1前病毒DNA的pX区的部分序列。

图1 T细胞淋巴瘤石蜡组织中HTLV-1前病毒PCR检测的部分结果

3 讨论

HTLV-1是人类发现的第一个逆转录病毒，在逆转录酶的作用下将病毒RNA逆转录为cDNA并整合到人类基因组DNA上，位于pX区的TAX基因在该病毒的致病过程中发挥重要作用，主要导致人类T细胞淋巴瘤(ATLL)，因此本实验根据参考文献[2]合成了针对TAX部分基因片段的两对引物。该病毒具有传染性并呈地域流行，主要流行于日本西南部，在我国的福建和广东的沿海地区有局部小流行[4]，海南地理及气候环境与广东相似，因而海南是否也存在HTLV-1流行引起关注。

本研究通过收集海南省三家医院病理科诊断为外周T细胞淋巴瘤的石蜡组织并依据2008年WHO分类，收集到的46例外周T细胞淋巴瘤中PTCL-U 20例、NK/T细胞淋巴瘤11例、CTCL 11例、ATLL 4例。运用PCR方法检测到外周T细胞淋巴瘤中HTLV-1前病毒阳性8例(占17.39%)与唐秋萍等[5]对海南省无偿献血人群HTLV-I/II血清抗体阳性率(0%)的调查相比，说明海南省外周T细胞淋巴瘤的发生与HTLV-1存在密切关系。本实验中ATLL患者的HTLV-1检出率高达75%，进一步证实了HTLV-1与ATLL的发病密切相关。CTCL中HTLV-1感染的发生率各家报道不一，从0～100%都有[6-9]，其相关性存在争议，本实验中CTCL患者的HTLV-1检出率为10%，与高红阳等[10]报道的CTCL中HTLV-1的检出率(10.5%)相近，说明HTLV-1感染与CTCL的发病可能存在一定关系。T/NK及PTCL-U与HTLV-1的关系国内还未见报道，不过日本曾有研究发现28例PTCL-U中HTLV-1阳性的6例[2]。

总之，以上研究结果表明HTLV-1除与ATLL发病密切相关外，与其他类型的T细胞淋巴瘤也存在一定关系，本实验成功提取外周T细胞淋巴瘤石蜡包埋组织中HTLV-I的cDNA，以后我们可以充分利用病理科石蜡组织的资源搜集更多的病例，进一步研究外周T细胞淋巴瘤各类型与HTLV-I的关系，同时，我们打算建立HTLV-1感染的动物模型，对其具体的致病机制做进一步研究。

(厦门大学熊君辉博士对本实验给予了无私的帮助，特此致谢！)

[1]Dogan A,Gaulard P,Jaffe E,et al.WHO Classification of Tumours of the Haematopoietic and Lymphoid Tissues[S].France:InternationalAgency for Research on Cancer,2008.

[2]Jun-ichi Miyagi,Takayoshi Toda,Hiroshi Uezato,et al.Detection of epstein-barr virus and human T-Cell lymphotropic virus type 1 in malignant nodal lymphoma，studied in okinawa,a subtropical Area in Japan[J].Int J Hematol,2002,75:78-84.

[3]江 炜,刘卫平,李 雷,等.石蜡包埋组织快速DNA提取方法在诊断病理PCR分析中的应用研究[J].四川大学学报(医学版), 2007,38(4):709-712.

[4]宋 蓓,戴启宇,王 辉.人类T淋巴细胞病毒及其相关疾病的研究进展[J].实用医药杂志,2009,26(8):73-75.

[5]唐秋萍,苏庆元,韩 慧,等.海南省无偿献血人群HTLV-Ⅰ/Ⅱ血清抗体阳性率调查[J].中国热带医学,2007,7(11):2164.

[6]Kikuchi A,Ohata Y,Matsumoto H,et al.Anti HTLV-1 antibody positivecutaneous T-celllymphoma[J].Cancer,1997,79(2): 269-274.

[7]Ghosh SK,Abrams JT,T erunuma H,et al.Human T-cell leukemia virus type I tax/rex DNA and RNA in cutaneous T-cell lymphoma [J].Blood,1994,84(8):2663-2671.

[8]Kikuchi A,Nishikawa T,Ikeda Y,et al.Absence of human T-lymphomatropic virus type I in Japanese patient s with cutaneous T-cell lymphoma[J].Blood,1997,89(5):1529-1532.

[9]Lapis P,Freeman J,Bitter MA,et al.Absence of HTLV-1 DNA sequences in cutaneous T-cell lymphoma/mycosis fungoides[J].Acta-Morphologica Hungarica,1992,40(1-4):249-255.

[10]高红阳,单易非,王 平,等.皮肤T细胞淋巴瘤患者的人类T淋巴细胞白血病病毒I型感染[J].复旦学报(医学版),2002,29(1): 36-38.

Primary study of HTLV-1 infection in paraffin-embeded PTCL tissues.

FAN Lin-lin1,TAN Shun1*,RAO Xiang1, ZHANG Ying-ai2,WANG Shi-hua3.
Department of Pathology1,Central Laboratory2,the Affiliated Haikou Hospital of Xiangya School of Medicine,Central South University,Haikou 570208,Hainan,CHINA;3.Department of Pathology, Hospital of Agricultural Reclamation of Sanya City,Sanya 572000,Hainan,CHINA

Objective To study the relationship between Human T cell leukemia virus type-1(HTLV-1) and peripheral T cell lymphoma(PTCL)by detecting the HTLV-1 infection in paraffin-embeded PTCL tissues.MethodsForty-six samples of PTCL were classified according to World Health Organization classification(2008). Genomic DNA extracted from PTCL was detected by PCR for previous DNA of HTLV-1.ResultsEight of the 46 samples showed positive results in the detection of HTLV-1.The detection rate of HTLV-1 was 3/20,1/12,1/10,and 3/4 for peripheral T cell lymphoma-unspecified(PTCL-U),NK/T cell lymphoma,cutaneous T-cell lymphoma(CTCL),and adult T-cell lymphoma(ATLL),respectively.ConclusionHTLV-1 infection is found in patients with PTCL.HTLV-1 may be related to other type of peripheral T cell lymphoma besidesATLL.

Peripheral T cell lymphoma;HTLV-1;Paraffin-embeded tissues

R37

A

1003—6350(2012)13—001—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.13.001

2012-02-13)

海南省自然科学基金（编号：808240）

凡琳琳（1986-），女山东省菏泽市人，医师，硕士。

谈 顺。E-mail:tsc116@163.com