螺旋藻粉β－胡萝卜素含量测定方法的优化*

赵 楠，李勇勇，邵明飞，郁章玉，3，秦 松

(1.曲阜师范大学化学与化工学院，山东 曲阜 273165;2.南京农业大学资源与环境科学学院江苏省海洋生物学重点实验室，江苏 南京 210095;3.菏泽学院化学与化工系，山东 菏泽 274015;4.中国科学院烟台海岸带研究所生物资源实验室，山东 烟台 264003)

螺旋藻是丝状的多细胞蓝藻，具有很高的药用及营养价值，被联合国粮油组织推荐为“21世纪最优秀的食品”.螺旋藻中β－胡萝卜素的含量非常丰富，所含的 β－胡萝卜素达 1 700 mg/kg(干重)［1］.β－胡萝卜素是维生素A的前体物质，大量研究证实β－胡萝卜素是有效的抗氧化剂，能消除人体中的活性氧，消除自由基，在防癌［2］抗癌［3］、预防心血管疾病，增强免疫功能［4］等方面有明显作用［5］.螺旋藻粉中的β－胡萝卜素含量为所有食物之冠，比胡萝卜中的β－胡萝卜素含量还要高出10倍［6］.β－胡萝卜素作为螺旋藻综合开发利用的一种功能因子，有很大的商业化前景.因此，有关螺旋藻中β－胡萝卜素成分的研究和测定方法倍受重视.目前常用的测定β－胡萝卜素含量的方法有纸层析法、分光光度法和高效液相色谱法［7，8］.由于高效液相色谱法样品的前处理较为麻烦且所需仪器昂贵，所以还未能广泛普及.而纸层析法步骤比较繁琐，故本文采用分光光度法进行螺旋藻粉β－胡萝卜素含量的测定，并对该方法操作条件进行优化.

1 材料与方法

1.1 材料

螺旋藻粉，2011年12月份购于广西，置于阴凉抽屉中避光保存.

1.2 试剂与仪器

仪器:恒温水浴锅，上海福玛试验设备有限公司产品;电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品;TU－1901紫外可见分光光度计，北京普析通用有限责任公司产品;50 mL具塞比色管，分液漏斗等.

试剂:标准β－胡萝卜素(Sigma公司产品，质量分数＞97%)，无水硫酸钠、正庚烷、丙酮、无水乙醇、甲苯、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、石油醚均为国产分析纯.

1.3 β－胡萝卜素最大吸收波长的测定及标准曲线的绘制［5］

取一定量的β－胡萝卜素标准品，溶解在石油醚中，在波长300～600 nm范围内，用紫外可见分光光度计进行波谱扫描，得到 β－胡萝卜素的特征吸收峰，作为β－胡萝卜素的测定波长.

准确称取2.50 mg β－胡萝卜素标准品，溶于石油醚，并定容于100 mL棕色容量瓶中，配制成25 ug/mL的β－胡萝卜素标准溶液，分别吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 于 5 个 10 mL 棕色容量瓶中，用石油醚定容，以石油醚为参比溶液，在450 nm处测定各样品的吸光度，并绘制标准曲线.

1.4 样品的测定

准确称取0.2 g左右的螺旋藻藻粉于50 mL的比色管中，加入30 mL提取剂和1 mL质量浓度为400 g/L的KOH溶液，混合均匀;比色管放于35℃恒温水浴中浸泡12 h后，将浸泡液过滤，滤液倒入内盛50 mL的20 g/L硫酸钠溶液的250 mL分液漏斗中，用10 mL提取剂冲洗滤渣，重复两次，将洗液、过滤液收集到分液漏斗中.向分液漏斗中加入30 mL乙醚及100 mL蒸馏水，振摇后静置分层，弃去下层溶液，上层溶液再重复萃取两次.萃取所得上层溶液通过一装有10 g无水硫酸钠的小漏斗滤入100 mL棕色容量瓶中，用少量石油醚洗涤分液漏斗，并洗去无水硫酸钠表面的色素，定容至刻度线，摇匀，用分光光度计测定其在450 nm处的吸光度.

1.5 提取剂

在50 mL具塞比色管中加入0.2 g螺旋藻粉后，再分别加入30 mL下列溶液:V(正庚烷)∶V(丙酮)∶V(无水乙醇)∶V(甲苯)=10∶7∶6∶7;V(石油醚)∶V(丙酮)=1∶1;V(甲醇)∶V(石油醚)=2∶1;乙酸乙酯;V(石油醚)∶V(丙酮)=4∶1;V(丙酮)∶V(氯仿)=1∶2;V(丙酮)∶V(甲醇)=7∶2;石油醚.其余步骤按1.4所述步骤进行操作.

1.6 浸提温度

在50 mL具塞比色管中加入0.2 g螺旋藻粉、30 mL 最佳提取剂后，分别于 25，35，45，55，65，75℃恒温水浴中浸泡12 h，其余步骤按1.4所述步骤进行操作.

1.7 提取剂体积

在50 mL具塞比色管中加入0.2 g螺旋藻粉后，再分别加入 15，20，25，30，35，40 mL 最佳提取剂，于最佳浸提温度恒温水浴中浸泡12 h，其余步骤按1.4所述步骤进行操作.

1.8 浸提时间

在50 mL具塞比色管中加入0.2 g螺旋藻粉、最佳提取剂体积的提取剂后，于最佳温度恒温水浴中，分别密封避光浸泡 2，4，6，8，10，12 h，其余步骤按1.4所述步骤进行操作.

1.9 正交试验设计

采用L9(33)正交试验表，以 V(正庚烷)∶V(丙酮)∶V(无水乙醇)∶V(甲苯)=10∶7∶6∶7为提取剂，选取浸提温度、提取剂体积、浸提时间3个因素，每个因素取3个水平，其因素水平见表1.

表1 L9(33)正交试验的因素水平

2 结果与分析

2.1 β－胡萝卜素的吸收光谱及标准曲线图

β－胡萝卜素的吸收光谱，如图1所示.从图1可见，β－胡萝卜素在波长300～600 nm范围内有两处较大的吸收峰，其中在450 nm处吸收峰值最大，是β－胡萝卜素的特征吸收峰，本试验选择450 nm作为β－胡萝卜素的测定波长.

图1 β－胡萝卜素光谱扫描曲线

β－胡萝卜素的质量浓度(ρ)在0～2.5 ug/mL范围内与吸光度值(A)呈现很好的线性关系，如图2所示.其标准曲线公式为:A=0.308 9ρ－0.008 8，r2=0.999 5.

图2 β－胡萝卜素的标准曲线

2.2 提取剂对β－胡萝卜素含量测定的影响

各提取剂对β－胡萝卜素含量测定的影响见表2.由表2知，V(正庚烷)∶V(丙酮)∶V(无水乙醇)∶V(甲苯)=10∶7∶6∶7为最佳提取剂，其提取到的β－胡萝卜素含量测定最高，以下实验中均以此为提取剂.

表2 提取剂对β－胡萝卜素含量测定的影响

2.3 浸提温度对β－胡萝卜素含量测定的影响

随着浸提温度的升高，β－胡萝卜素的测定含量呈先增大后减小的趋势，见表3.当恒温水浴温度为35℃时，β－胡萝卜素测定的含量最大，为134.15 mg/100g.此后随着恒温水浴温度的升高，β－胡萝卜素的测定含量开始平缓地减小.这表明适当地提高浸提温度可提高β－胡萝卜素的测定含量，过高的温度可能会影响β－胡萝卜素的稳定性，可能会使β－胡萝卜素发生降解而被破坏，使得β－胡萝卜素的测定含量较低.

表3 浸提温度对β－胡萝卜素含量测定的影响

2.4 提取剂体积对β－胡萝卜素含量测定的影响

当提取剂体积为30 mL时，提取效果较好，此时提取物中的β－胡萝卜素的测定含量达到最高值，见表4.试验表明，提取剂的体积过大或过小，都不利于β－胡萝卜素的提取，因此30 mL为最佳提取剂体积.

表4 提取剂体积对β－胡萝卜素含量测定的影响

2.5 浸提时间对β－胡萝卜素含量测定的影响

当浸提时间为12 h时，浸提效果最好，此时提取物中的β－胡萝卜素测定含量达到最高值为134.15 mg/100 g，见表5.浸提时间过短，不利于β－胡萝卜素的充分溶出.随着浸提时间的延长，β－胡萝卜素测定含量逐渐增大.

表5 浸提时间对β－胡萝卜素含量测定的影响

2.6 正交设计优化提取工艺

β－胡萝卜素含量测定的正交试验结果见表6.由表6可知，影响β－胡萝卜素含量测定的因素依次为:浸提温度＞提取剂体积＞浸提时间，最佳提取工艺为A2B2C3，即以V(正庚烷)∶V(丙酮)∶V(无水乙醇)∶V(甲苯)=10∶7∶6∶7为提取剂，提取剂体积为30 mL，浸提时间为12 h，浸提温度为35℃.

表6 L9(33)正交试验结果与分析

3 讨论与结论

1)β－胡萝卜素易被氧化，见光易分解，故本试验须在遮光条件下进行.样品在提取过程中，遮光条件下浸泡12 h，在一定程度上减少了β－胡萝卜素的损失，从而提高了β－胡萝卜素的测定含量.

2)通过正交试验得出，提取β－胡萝卜素的最佳工艺条件为:V(正庚烷)∶V(丙酮)∶V(无水乙醇)∶V(甲苯)=10∶7∶6∶7为提取剂，提取剂体积为30 mL，35℃下浸提12 h;在最佳工艺条件下β－胡萝卜素的测定含量为134.5 mg/100 g.

3)本试验方法简单，实验所需仪器均较为普通，便于企业生产过程对β－胡萝卜素进行快速检测及监控.

［1］王文博.螺旋藻的生物活性成分分析及其免疫特性研究［D］.呼和浩特:内蒙古农业大学，2009.

［2］赵文恩，韩雅珊，苏震，等.类胡萝卜素对H2O2－NaClO体系生成的1O2的淬灭作用［J］.生物物理学报，1997，13(1):137－142.

［3］Gregory G K，Chen T S，Philip T.Quantitative analysis of lutein esters in marigold flowers(Tagetes erecta)by high performance liquid chromatography［J］.Food Sci，1986，51(4):1093－1095.

［4］房明.螺旋藻β－胡萝卜素的提取及生物活性研究进展［J］.现代农村科技，2012，(1):70－71.

［5］李新，安鑫南，刘震.β－胡萝卜素原料筛选及其超临界二氧化碳萃取［J］.南京林业大学学报，1999，23(3):37－40.

［6］郑静.螺旋藻化学成分及其生物活性研究［J］.科技信息，2009，(7):25－27.

［7］赵厚民，徐慧，周小平.螺旋藻中β－胡萝卜素高效液相色谱测定方法的研究［J］.中国野生植物资源，2005，24(3):43－45.

［8］卢红梅，梁逸曾.高效液相色谱法测定食物中的类胡萝卜素［J］.色谱，2005，23(1):57－62.