双波长分光光度法测定饲料中铁含量

淮海工学院化学工程学院 李咏梅 施鹏飞

连云港师范高等专科学校 李人宇＊

铁是动物的必需微量元素之一。日粮中铁含量不足会引起动物生长受阻，血红蛋白合成不良，从而出现贫血症（张元跃，2002），而动物摄入过量铁则会发生铁中毒（杨顺江，1989）。因此，准确测定饲料中铁含量具有重要意义。二元络合物体系邻菲啰啉光度法是测定铁的传统方法，此法灵敏度较低，反应2 h后才能稳定可测，且选择性较差（王书华和董士元，1997）。近年来，三元络合物体系光度法因具有灵敏度高、稳定性好、选择性好等优点应用日益增多（王爱荣等，2005）。此外，双波长分光光度法因能提高准确度、灵敏度和选择性等分析性能而备受关注（陈孝进等，2012；毕韶丹等，2008）。本实验利用铁（Ⅱ）-邻菲啰啉-灿烂黄三元络合物体系，建立双波长分光光度法测定饲料中铁含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 756CRT型紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），HH-2数显恒温水浴锅 （国华电器有限公司），pHS-3C型酸度计（上海精密科学仪器有限公司），XS2马弗炉（宜兴市前锦炉业设备有限公司）。

铁（Ⅱ）标准储备溶液（100 μg/mL）：准确称取0.7020 g 硫酸亚铁铵，溶于硫酸 （V∶V=1∶1）50 mL中，定容于1 L容量瓶，贮存于聚乙烯瓶中，4℃保存。铁（Ⅱ）标准工作溶液（10 μg/mL）：精密吸取10.0 mL铁（Ⅱ）标准贮备溶液，用水稀释定容至100 mL；乙酸-乙酸钠缓冲溶液：pH 5.7；邻菲啰啉溶液：1.0 ×10-3mol/L；灿烂黄溶液：1.0 ×10-4mol/L。实验所用硫酸、盐酸、盐酸羟胺均为优级纯，其他试剂为分析纯，水为双蒸水。

1.2 实验方法 在10mL比色管中依次加入1.0 mL pH 5.7乙酸-乙酸钠缓冲溶液，一定量铁（Ⅱ）标准工作溶液或样品溶液，1.5 mL 1.0×10-3mol/L邻菲啰啉溶液和3.0 mL 1.0×10-4mol/L灿烂黄溶液，用水定容并摇匀，室温下静置15 min。同时配制空白试剂。用1 cm比色皿，以空白试剂为参比，分别于波长493 nm和379 nm处，测量络合物体系的吸光度A493和A379，按公式△A=A493–A379，计算吸光度差值△A。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱 以水为参比，分别扫描空白试剂、络合物溶液，吸收光谱，结果见图1。由图1可见，在pH 5.7乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，空白试剂的最大吸收波长位于387 nm。当铁（Ⅱ）加入其中后，使灿烂黄褪色，379 nm处的吸光度随着铁（Ⅱ）浓度增大而减小；生成络合物的最大吸收峰位于493 nm，493 nm处的吸光度随着铁 （Ⅱ）浓度增大而增大。由于△A值与铁（Ⅱ）浓度存在很好的线性关系，故选取λ1=493 nm作测量波长，λ2=379 nm作参比波长，采用双波长光度法测定。

2.2 测定条件的优化

2.2.1 酸度的影响 不同酸度的介质对络合反应的发生与进程有很大影响，分别以乙酸-乙酸钠（pH3.6～ 5.7），乙酸铵 （pH7.0）和氨-氯化铵（pH7.5～11.0）缓冲溶液作为反应介质进行试验，结果表明，选择pH 5.7乙酸-乙酸钠缓冲溶液控制体系酸度，且用量为1.0 mL时，△A值最大（图2、图3）。而当pH＜4.0时，试剂空白褪色太快无法准确测定吸光度；当pH＞8.0时，△A值接近零，说明反应基本不发生。因此，本实验选择加入pH 5.7乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用量为1.0 mL。

2.2.2 邻菲啰啉用量的影响 邻菲啰啉用量对络合物的生成有较大影响。当1.0×10-3mol/L的邻菲啰啉溶液用量为1.5～3.0 mL时，ΔA值最大 （图4）。而当邻菲啰啉用量小于1.5 mL时，邻菲啰啉与铁（Ⅱ）络合形成 Fe（phen）32+的能力减弱，反应速度变慢，反应不完全且难以稳定，ΔA值较小，测定的准确性和灵敏度均降低。本实验确定邻菲啰啉溶液加入量为1.5 mL。

图1 吸收光谱

2.2.3 灿烂黄用量的影响 灿烂黄用量对络合物的生成有较大影响。当1.0×10-4mol/L灿烂黄溶液用量为2.8～4.0 mL时，△A值最大（图5）。而当灿烂黄用量小于 2.8 mL 时，Fe（phen）32+与灿烂黄阴离子之间的静电引力和疏水作用力减弱，反应速度变慢，不利于络合反应的完成，△A值较小，测定的准确性和灵敏度均降低。本实验确定灿烂黄溶液的加入量为3.0 mL。

2.2.4 反应温度的影响 由图6可见，当温度为10～40℃时，△A值基本不变；当温度为50～100℃时，△A值升高但很不稳定。这是由于高温条件会使络合体系产生浑浊，使△A值增大且不稳定。为了保证测定的准确度，并便于操作，本实验选择室温下反应。

2.2.5 反应时间与稳定性 由图7可见，反应开始后，△A值迅速增大，反应15 min时，△A值达到最大，并保持6 h基本不变。本实验选择反应时间为15 min。本方法生成的三元络合物与王书华和董士元（1997）报道的二元络合物相比，稳定性明显提高，反应时间由2 h缩短为 15 min，大大提高了分析效率。

2.3 工作曲线与检出限 在一组10 mL比色管中，分别准确加入10 μg/mL铁（Ⅱ）标准工作溶液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL， 按实验方法测量体系吸光度，绘制工作曲线（图8）。由8可见，线性范围为0～1.2 μg/mL，线性回归方程为 ΔA=0.5858 Ρ （μg/mL）+0.0075， 相关系数r=0.9999。 表观摩尔吸光系数 ε=3.3×104L/mol·cm，较何建英等（2003）二元络合物体系邻菲啰啉光度法灵敏度提高2倍。对空白试剂进行11次测定，求得标准偏差s=2.7×10-3，方法检出限为DL=3s/k=13.8 μg/L。

2.4 共存离子的影响 在上述实验条件下，对10mL溶液中10 μg铁 （Ⅱ）进行测定，相对误差≤ ±5%范围内，常见离子的允许量（以μg计，未做上限）分别为：Na+、NH4+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Pb2+、Cd2+、Al3+、I-、NO3-、SeO32-（1000），K+、Cr3+、OH-、HCO3-、CO32-、Br-（500），Zn2+（100），Co2+、Ni2+、Cu2+、Fe3+（10）。结果表明，该方法具有良好的选择性。加入0.5 mL 0.5%柠檬酸可掩蔽1 mg Ni2+，加入0.4 mL 5%硫脲溶液可掩蔽1 mg Cu2+，加入1.2 mL 0.5%氟化钠可掩蔽1 mg Fe3+（用于价态分析）。对于常见饲料无需掩蔽可直接测定。

3 样品分析

准确称取适量饲料样品（豆粕2.0 g，玉米5.0 g）于瓷坩埚中，放在电热板上低温炭化至无烟，再放入马弗炉于500℃下灰化4～5 h，直至试样灰化完全后取出。 稍冷加入 5 mL（V∶V=1∶1）盐酸，加入1 mL 10%盐酸羟胺溶液，放在电热板上加热微沸数分钟，以保证全部铁的溶解和还原，冷却后移入50 mL容量瓶中，用水定容、过滤。精密吸取1.0 mL按实验方法测定铁含量，测定结果与国标法一致（表 1）（GB/T 13885-2003，2003）。 同时进行加标回收实验，结果见表2。

表1 回收率实验结果

表2 饲料样品中铁含量的测定结果（n=5）

4 结论

本实验建立了铁 （Ⅱ）-邻菲啰啉-灿烂黄三元络合物体系双波长分光光度法测定饲料中的铁含量，方法灵敏度和稳定性明显优于传统的邻菲啰啉光度法，测定快速准确，精密度高，选择性好，完全满足饲料中铁含量的检测要求。

[1]毕韶丹，高俊杰，余萍.微乳液双峰双波长法测定水样中的微量铁[J].广东微量元素科学，2008，15（11）：57 ～ 59.

[2]陈孝进，王菊纲，彭兰，等.紫尿酸双波长叠加光度法测定水中微量铁[J].化学分析计量，2012，21（2）：72 ～ 74.

[3]何建英，陈丹云，丁彦廷.邻二氮菲分光光度法测定豆类中铁的含量[J].河北化工，2003，5：61 ～ 62.

[4]王书华，董士元.紫外分光光度法测定饲料中的铁[J].粮食与饲料工业，1997，8：41.

[5]王爱荣，谷永庆，王少冷.微量铁的分光光度测定概述[J].广东微量元素科学，2005，12（9）：5 ～ 10.

[6]杨顺江.动物微量元素营养学[M].湖北：湖北科学技术出版社，1989.125～138.

[7]张元跃.动物的铁需要量与补铁[J].中国饲料，2002，7：22 ～ 23.

[8]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 13885-2003[S].动物饲料中钙、铜、铁、镁、锰、钾、钠和锌含量的测定：原子吸收光谱法.北京：中国标准出版社，2003-11-01.