结核分枝杆菌Rv3803c、Rv3846基因的克隆、表达、纯化与鉴定

孙毅凡 李海成 周杰 钱明 陈涛 江勇 赖赛麟 江振友 钟球 周琳

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的。据报道，2010年全球结核病新增患者约有880万［1］。我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病的14%，位居全球第2位［2］。我国结核病疫情仍很严重，因此围绕研发保护性疫苗、改进诊断技术一直是结核病基础研究的热点。

结核分枝杆菌能分泌大量的免疫原性蛋白，其中由Rv3803c基因编码的MPT51蛋白，与Ag85复合体有很大程度的同源性［3］，其可能作为有效的保护性抗原在结核分枝杆菌感染免疫中发挥重要作用。SodA由结核分枝杆菌Rv3846基因编码，是一种由致病性分枝杆菌大量分泌的毒力因子，可将宿主巨噬细胞产生的氧自由基转换为过氧化氢［4］，从而对抗巨噬细胞的氧化攻击。笔者克隆表达了Rv3803c、Rv3846基因，对其编码的蛋白 MPT51、SodA进行纯化鉴定，为进一步探讨相关分泌抗原的辅助诊断价值，构建保护性疫苗及筛选药物靶点等奠定实验基础。

材料和方法

一、菌种和载体

Mtb H37Rv标准菌株为本中心保存，大肠埃希菌（E．coli）TOP10菌株、E．coli Rosetta菌株购自中国Transgen公司，pGEX－6P－1载体（氨苄青霉素抗性，多克隆位点BamHⅠ，EcoRⅠ，SmaⅠ，SalⅠ，XhoⅠ，NotⅠ）购自美国GE公司。

二、酶和试剂

限制性内切酶、T4连接酶、Pyrobest DNA聚合酶均购自日本TaKaRa公司，谷胱甘肽巯基转移酶（anti－GST）鼠单抗购自美国Santa Cruse公司，辣根过氧化物酶（HRP）偶联的兔抗鼠二抗购自美国promega公 司，异 丙 基－β－D－硫 代 吡 喃 半 乳 糖 苷（IPTG）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、氨苄青霉素、还原性谷胱甘肽购自鼎国生物公司，Glutathione Sepharose 4B购自美国GE公司，电化学发光液（electrochemiluminescence，ECL）购自美国Pierce公司。

三、Rv3803c、Rv3846基因重组质粒的构建、表达和纯化方法

（一）基因克隆和鉴定

以H37Rv基因组DNA为模板分别扩增Rv3803c、Rv3846。

Rv3803c上 游 引 物：5′－GTACATGGATCCATGAAGGGTCGGTCGGCGCTGCTGC－3′； 下游引物：5′－GTACATCTCGAGTTAGCGGATCGCACCGACGATATCG－3′。

Rv3846上 游 引 物：5′－GTACATGGATCCATGGCCGAATACACCTTGCCAGACC－3′； 下游 引 物：5′－GTACATCTCGAGTCAGCCGAATATCAACCCCTTGGTC－3′。

Rv3803c的PCR扩增反应条件：94℃3min，94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 70s，30个循环；Rv3846的PCR扩增反应条件：94℃3min，94℃30s，62℃1min，72℃1min，30个循环。

PCR产物经BamHⅠ、XhoⅠ内切酶酶切之后，1%琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，T4连接酶连接到表达载体 pGEX－6P－1，转化到E．coliTOP10中，送美国Invitrogen公司中国分部测序。

（二）重组质粒的构建和诱导表达

把测序正确的重组质粒转化到E．coli Rosetta中，准备表达重组蛋白。挑单克隆于5ml含50μg／ml氨苄青霉素的LB（lysogeny broth，溶菌肉汤）培养基中过夜活化培养，第二天以1∶100的体积接种到200ml含50μg／ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃培养至A600＝0．5～0．6时，加入终浓度为0．4mmol／L的IPTG，16℃诱导培养8h。

（三）重组蛋白免疫印迹（Western blot）鉴定

1．免疫印迹鉴定：取大约1个A600量（1×109）的菌，超声破菌（100W 功率，超声发射5s，静止10s，连续进行5min），4℃，20 000g离心15min，分开上清液和沉淀；为了检测目的蛋白在上清（可溶）还是沉淀（包涵体）中，上清和沉淀分别加入等量的电泳上样缓冲液，沸水浴煮6min。取5μl进行SDS－PAGE（十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶）电泳。电泳后半干转膜（15V，45min）。转印后的PVDF（聚偏氟乙烯）膜用含5%脱脂奶粉的PBS（磷酸盐缓冲液）室温封闭1h，anti－GST单抗1∶2000室温标记1h，HRP偶联的兔抗鼠二抗1∶5000标记1h，加入ECL液显影。

2．考马斯亮蓝染色鉴定：纯化蛋白和BSA标准品进行SDS－PAGE电泳。电泳后的SDS－PAGE胶用考马斯亮蓝染液过夜染色，然后用脱色液脱色至条带清晰出现。

3．表达产物的纯化：3000g离心10min，收集诱导后的菌体，10ml含2mmol PMSF的PBS重悬，超声破菌（100W功率，超声发射5s，静止10s，连续进行5min）；4℃，20 000g离心15min，上清液加入100μl Glutathione Sepharose 4B微珠，4℃孵育12h。4℃，500g离心5min收集微珠，用含1%tritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚－100）的PBS液洗3次，最后用含10mmol／L还原性谷胱甘肽的50mmol／L pH8．0的Tris－HCl（三羟甲基氨基甲烷）洗脱蛋白。

结 果

1．Rv3803c、Rv3846基因扩增结果：以 H37Rv为模板，分别扩增得到大约900bp、600bp的基因片段（图1），与Rv3803c、Rv3846基因的理论值相符。限制性内切酶消化后，连接到pGEX－6p－1载体上，构建pGEX－Rv3803c、pGEX－Rv3846重组质粒。测序后与H37Rv比对显示：重组质粒Rv3803c、Rv3846编码基因与H37Rv上基因核苷酸序列完全一致。

图1 A：Rv3803c基因PCR扩增结果（900bp）；B：Rv3846基因PCR扩增结果（620bp）

2．GST－Rv3803c和 GST－Rv3846重组蛋白在E．coli中表达的可溶性分析：含有重组质粒的E．coli Rosetta用1mmol IPTG 诱导后，超声破碎菌，20 000g离心15min，分开上清液（可溶性部分）和沉淀（包涵体），等体积加入上样缓冲液，Western blot鉴定。GST－Rv3803c和 GST－Rv3846两个重组蛋白在上清液（可溶性部分）和沉淀（包涵体）中的含量大致相等（图2），故其在E．coli Rosetta中的存在形式均为可溶部分约50%，包涵体形式约50%，相对分子质量分别约为56 000和45 000。

图2 GST－Rv3803c和GST－Rv3846融合蛋白在E．coli中表达的可溶性分析

3．重组蛋白纯化结果鉴定：含有重组质粒的E．coli Rosetta诱导并超声破碎的上清液与Glutathione Sepharose 4B微珠孵育，亲和纯化目的重组蛋白。纯化后的目的重组蛋白进行考马斯亮蓝染色（图3A）和 Western blot（图3B）鉴定。有完整的融合蛋白被纯化出来，纯化的GST－Rv3803c、GST－Rv3846样品纯度90%以上，但由于GST－Rv3803c纯化后降解较严重，最终只能得到10%未降解的完整蛋白。完整的GST－Rv3803c的浓度大约为0．1mg／ml，完整的GST－Rv3846的浓度大约为0．5mg／ml。相当于每升E．coli Rosetta培养物中，GST－Rv3803c产量为：0．25mg／L、GST－Rv3846产量为1．25mg／L。

图3 A：GST－Rv3803c和GST－Rv3846融合蛋白亲和纯化及考马斯亮蓝染色鉴定；B：GST－Rv3803c和GST－Rv3846融合蛋白亲和纯化及 Western blot鉴定

讨 论

近年来，结核分枝杆菌分泌性蛋白的相关研究一直备受关注。目前对多种分泌性蛋白的研究发现结核分枝杆菌生长期分泌的蛋白，如MPT51、SodA等在结核感染免疫中发挥了重要作用，为构建保护性疫苗提供了新的思路。

MPT51蛋白的编码基因是Rv3803c，又称fbpC1。其相对分子质量约为27 000，是一种非催化性的α／β水解酶，且与Ag85复合体有较高同源性。MiKi等［5］报道，MPT51可在小鼠的脾细胞中介导Ⅰ型细胞免疫。Bethunaickan等［6］以重组Rv3803c为抗原对结核患者IgG、IgA、IgM水平进行检测，IgG特异度为98%，IgG＋IgA敏感度为71%，均显著高于健康对照组，具有一定的诊断价值。Siev等［7］发现，HIV感染和未感染的结核和非结核患者中，抗MPT51的抗体检测在血清和血浆样品中显著相关。此外，MPT51作为候选蛋白在构建疫苗中的免疫学作用也受到关注。Silva等［8］发现重组MPT51／CpG的DNA疫苗接种能够为结核感染小鼠模型提供一定的保护作用。Wang等［9］的研究也表明，其在结核感染中发挥关键的保护作用。因此，纯化出MPT51，可为进一步探讨其辅助诊断价值、构建保护性疫苗等做出必要准备。

超氧化物歧化酶（SOD）是需氧微生物普遍存在的一种催化超氧自由基转化为过氧化氢的金属酶。结核分枝杆菌中有2种SOD，其中SodA由Rv3846基因编码，对病原体有明显的保护作用。研究发现SodA的分泌依赖一种辅助分泌因子Sec2，此种Sec2依赖性的蛋白输出方式参与某种特异性分泌系统，是结核分枝杆菌逃避宿主Mφ氧化攻击的毒力机制之一［10］。结核感染动物模型中，降低结核分枝杆菌SOD的产生，可加快单核细胞向肺部浸润及细胞凋亡，提示SOD在结核致病过程中发挥重要作用［11］。Khera等［12］发现表达 SOD 的 DNA 疫苗能产生较高水平的IFN－γ，且保护作用最强。新近文献报道，SodA在BCG中的过量表达可导致BCG的免疫效力丧失［13］。以上各项结果说明纯化鉴定分泌抗原SodA，对深入研究SodA的分子致病机制，探讨其作为疫苗候选蛋白的可能性建立了一定的实验基础。

本研究以pGEX－6P－1为载体，在E．coli Rosetta菌中诱导表达，其补充了E．coli缺乏的6种稀有密码子（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA）对应的tRNA，可明显提高外源基因在原核系统中的表达水平。采用GST标签亲和层析法成功纯化出了GST－Rv3803c和GST－Rv3846蛋白，以期进一步探讨结核分枝杆菌分泌性蛋白MPT51、SodA在与宿主巨噬细胞相互作用时，Toll样受体、细胞凋亡等相关信号通路变化，以及细胞因子相关免疫平衡等分子免疫机制及其在结核防治转化中的应用。

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