熊果酸对二乙基亚硝胺诱发小鼠肝癌前病变的防护作用*

毛文超 宋艺君 张 健 焦艺博 冯丽莉 白荟芳 王秀萍 蔡大勇 王玥琦

1.北京中医药大学基础医学院 (北京，100029) 2.中国医学科学院药用植物研究所

笔者观察熊果酸和熊果酸联合枸杞子对二乙基亚硝胺诱导的小鼠肝癌前病变的防护作用，对比此两种用药方法的疗效，为临床联合用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 实验动物：昆明种小鼠，雄性，体重20～22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号 SCXK-京-2006-0009。药品试剂：①二乙基亚硝胺(DEN)：0.95g/ml，批号：078K1635，美国Sigma公司产品。99 ml生理盐水加1ml DEN振荡混匀为1% 的DEN溶液 (4℃保存)。②熊果酸：南京泽朗医药科技有限公司生产 (纯度90.012%)，加蒸馏水配制成浓度为15mg/ml的熊果酸药液。③枸杞子水煎液：枸杞子购于北京圣惠堂中药饮片有限公司(批号：090422)，称取枸杞子67.8g，加10倍水煮沸后，文火煎煮30分钟，煎煮两次，3层纱布过滤，收集滤液浓缩至370ml，即浓度为0.18g/ml的枸杞子水煎液，4℃储存备用。④肝功能试剂盒：包括丙氨酸转氨酶 (ALT)、天冬氨酸转氨酶 (AST)、碱性磷酸酶 (ALP)、谷胱甘肽S-转移酶 (GST)检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所 (批号：20100205)。主要仪器：Multiskan MK3酶标仪 (上海热电仪器有限公司产品)，AL104-IC型精密电子天平 (上海梅特勒托利多仪器有限公司)，LG16-W型台式高速离心机 (北京京立离心机有限公司)，电子恒温水浴箱 (北京长风仪器仪表公司)，定量移液器 (上海大龙医疗设备有限公司)，德国LETIZ公司FS/FAS 5030石蜡切片机，日本滨松Nano Zoomer Digital Pathology数字病理扫描系统等病理科常规设备。Image-Pro Plus 7.0 morphometric analysis system(版本 7.0.1，序列号41N70000-60555，Media Cybernetics，USA)，JJ1000型电子分析天平 (美国双杰兄弟集团有限公司常熟双杰测试仪器厂)。

1.2 动物分组处理 40只小鼠体重均衡随机分为4组，即正常组、模型组、熊果酸组、联合用药组。腹腔注射及灌胃剂量均按小鼠体重计。正常组小鼠每周1次 (周六12am)行腹腔注射生理盐水 0.1ml/10g，连续 10次;同时 1次/d，(8am)灌胃生理盐水0.1ml/10g，连续10周。模型组小鼠每周1次 (周六12am)行腹腔注射1%DEN溶液0.1ml/10g，连续10次，复制小鼠肝癌前病变模型。熊果酸组小鼠，造模型方法同模型组，同时1次/d(8am)灌胃熊果酸 (4.5mg/20g)药液0.1ml/10g，共10周。联合用药组小鼠造模同模型组，同时1次/d，(8am)灌胃熊果酸药0.1ml/10g，每天4pm灌胃枸杞子 (12mg/10g)水煎液0.1ml/10g，连续10周。

1.3 观察指标检测 ①一般状况：实验过程中每日观察记录小鼠进食状况、体重、活动情况及外表征象。②肝功能变化：第10周时，小鼠禁食12小时后称量体重 (Wb)，眼球后静脉取血0.5ml，全血离心 (1 500rpm×10min)，血清-80℃保存。按试剂盒说明书测定ALT、AST、GST、ALP活性。③肝脏系数：小鼠取血后脱臼处死，沿腹正中线切口进腹腔，切取全部肝脏，生理盐水清洗血迹，滤纸吸干生理盐水，称重肝脏质量 (Wl)，结合体重计算肝脏系数 (Wb÷Wl×100%)。④病理变化：切取肝脏右叶，10ml 10%甲醛溶液固定48小时，常规石蜡包埋，4μm切片;同步烤片与脱蜡，梯度酒精水化，HE染色。20倍物镜和光镜观察质控苏木素分化时间 (4秒最清晰)。梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片;光镜下胞浆红染，核蓝染。按标准操作规范，使用Olympus显微镜20倍物镜下随机摄拍肝细胞团显微照片5张，由病理医师阅片、诊断和评价，确定肝损伤病变性质和病变程度。⑤形态计量：由于肝细胞水肿与增生肝细胞核异型性两类病变分布均一，并且程度类似，符合形态计量的基本技术要求。20倍HE染色显微照片，Image-Pro Plus显微分析系统，形态计量肝索面积构成比和增生肝细胞核面积构成比。每只动物5张20倍显微照片的平均数为1个统计数据。再以正常组与模型组平均数值，转化原始数据为效能单位X=(Xi-Mcontrol) /(Mmodel-Mcontrol)，作矩形图显示用药防护程度。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件处理数据。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 各组小鼠的一般状态 正常组小鼠活泼好动，反应灵活，皮毛光泽，体重逐渐增加，无死亡;模型组小鼠精神萎靡，行动迟缓，食欲不振，皮毛枯槁、无光泽，体重先增加后降低，死亡1只;熊果酸组和联合用药组小鼠症状改善，活动度和食量比模型组小鼠增加，精神尚可。

2.2 各组小鼠体重与肝系数 见表1。

表1 各组小鼠体重与肝系数比较(±s)

表1 各组小鼠体重与肝系数比较(±s)

与正常组比较，a P ＜0.05，aa P ＜0.01; 与模型组比较，b P ＜0.05，bb P ＜0.01;与熊果酸组比较，c P ＜0.05，cc P ＜0.01

组别 用药剂量(mg/kg)体重(g)肝脏重量(g)肝脏系数(%)正常组- 39.865 ±3.725 1.429 ±0.175 52.6223 ±1.9856模型组 - 29.50 ±4.84aa 1.124 ±0.246a 50.4783±3.2354a熊果酸组 225 30.29±1.601b 1.205±0.124b 51.5632 ±3.0297b联合用药组 112.5+1200 32.06 ±1.544bbc 1.352 ±0.069c 53.1209 ±1.4863c

2.3 各组小鼠血清肝功能情况 见表2。

表2 各组小鼠血清肝功能比较(±s，U/L)

表2 各组小鼠血清肝功能比较(±s，U/L)

与正常组比较，a P＜0.05，aa P ＜0.01; 与模型组比较，b P ＜0.05，bb P ＜0.01;与熊果酸组比较，c P ＜0.05，cc P ＜0.01

组别ALT AST GST ALP正常组21.87 ±4.964 14.783 ±2.061 13.504 ±2.481 5.093 ±1.640模型组225.07 ±85.811aa 52.205 ±14.083aa 42.308 ±13.685a 25.141 ±3.638aa熊果酸组68.04 ±14.400bb 25.118 ±2.776bb 21.721 ±4.726bb 19.937 ±5.259b联合用药组63.73 ±27.407bbc 24.835 ±5.411bbc 18.590 ±3.81bc 22.525 ±5.101

2.4 各组小鼠肝脏病理情况 正常组小鼠肝脏结构正常，有肝小叶和汇管区 (见插页图1A)。肝小叶为规则肝细胞团;肝细胞索以中央静脉为中轴，单行呈放射状排列;相邻肝板吻合连接成网状，延伸到肝小叶周边的界板。肝细胞为多面体形，肝细胞核圆，位于细胞中央，染色质稀疏，着色较浅，核膜清楚，有1～2个核仁。肝细胞索之间为肝血窦，有内皮与枯否氏细胞;汇管区：小叶之间的区域，有肝动脉、门静脉、胆管和少量结缔组织，无显著变性与坏死，无水肿、出血与浸润。

模型组小鼠肝脏以肝细胞发生变质与增生为主要病变(见插页图1B)，包括细胞水肿与溶解坏死。肝细胞体积增大，胞浆淡染，胞浆内水含量增加。肝细胞坏死发生在肝小叶内、累积1个或几个肝细胞的点状坏死，未累及肝小叶界板的破坏;坏死灶原有肝细胞消失，代以浸润的淋巴细胞或浆细胞;累及肝小叶界板的点状坏死为碎片状坏死。累积十几个或几十个肝细胞的带状坏死，不累及肝小叶界板的破坏;坏死灶原有肝细胞消失，网状纤维塌陷代以胶原纤维。累及肝小叶界板的带状坏死为桥接坏死。肝细胞增生：细胞浆嗜碱性染色，可有双核。增生肝细胞具有癌细胞样异型性，表现为细胞体积大，且大小不一致;细胞核的体积大、染色深与形态怪异，核仁数量多、体积大，甚至出现核内包涵体;颗粒状蓝染胞浆，分布不均匀。汇管区可找到胆管增生和淋巴细胞浸润。

熊果酸组小鼠肝脏病变性质与模型组类似，程度减轻(见插页图1C)。增生细胞异型性较模型组减轻。溶解坏死很少累及肝小叶界板。汇管区有少量胆管增生和淋巴细胞浸润。

联合用药组小鼠肝脏病变性质与模型组类似，程度减轻显著 (见插页图1D)。病变缓解，中央静脉明显，肝索放射状排列，肝细胞异型性小，双核细胞少见。汇管区有极少量淋巴细胞浸润。

2.5 4 组小鼠肝脏的病变程度 见图2。形态计量数据分析见表3。结果显示：与正常组比较，造模各组肝索构成比、核构成比显著增加 (P＜0.01)，汇管区构成比增加 (P＜0.05);与模型组比较，熊果酸组防治有效 (P＜0.05);联合用药组疗效优于熊果酸组 (P＜0.01)。效能单位转化 (图2)显示，熊果酸对肝癌前病变有预防作用 (P＜0.05)，熊果酸与枸杞子联合用药的预防作用强于单用熊果酸 (P＜0.01)。

图24 组小鼠肝脏病变程度的效能趋势(x¯±s，ni=8)

表34 组小鼠的肝脏病变比较(±s，ni=8)

表34 组小鼠的肝脏病变比较(±s，ni=8)

与正常组比较，a P＜0.05，aa P ＜0.01; 与模型组比较，b P ＜0.05，bb P ＜0.01;与熊果酸组比较，c P ＜0.05，cc P ＜0.01

组别 汇管区构成比(v/v)肝索构成比(v/v)核构成比(v/v)正常组0.0086 ±0.0015 0.5141 ±0.0504 0.0143 ±0.0038模型组0.0435 ±0.0025a 0.7269 ±0.0166aa 0.0650 ±0.0035aa熊果酸组0.0301 ±0.0036b 0.6351 ±0.0235b 0.0481 ±0.0113bb联合用药组0.0182 ±0.0025bbcc 0.5847 ±0.0150bbc 0.0274 ±0.0074bbcc

3 讨论

肝癌危害大［1］，在我国尤为明显［2］，仍无有效防治办法［3］。探索传统中药预防肝癌发病，有可能确定有效物质［4］。按中医药理论，夏枯草、女贞子、山楂等含熊果酸的中药大多归肝经，具有清肝火、散郁结、清热解毒等功效，为证候特征依赖性肝癌预防类中药，具有护肝、降脂、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学活性［5，6］。大量研究表明熊果酸能通过多种机制诱导多种肿瘤细胞凋亡：①熊果酸对肿瘤的化学预防作用;②熊果酸的细胞毒活性;③熊果酸诱导肿瘤细胞凋亡作用;④肿瘤逆转作用及抗侵袭性;⑤抑制肿瘤血管形成［7，8］。小鼠具有可基因干预发现靶点的优势，二乙基亚硝胺诱发小鼠肝癌前病变模型被用于研究预防肝癌药物筛选［9］。肝癌前病变往往与肝肾证候同患，熊果酸与枸杞子配伍成临床方剂，预防肝癌前病变［4］。本研究以二乙基亚硝胺诱发肝癌前病变［10］的小鼠为研究对象，以临床等效剂量的熊果酸或配伍枸杞子水提物［11］灌胃进行预防，观察小鼠体重、肝脏系数、肝功能损害、病理变化及其形态计量［12］，确定熊果酸对肝癌前病变的防治效应。

本实验结果表明熊果酸对肝癌前病变具有预防作用，与枸杞子联用预防效果增强。突出表现在小鼠体重回升、肝系数恢复、肝功能异常缓解、增生肝细胞异型性减小，形态计量上降低核异型性显著。

二乙基亚硝胺损害生物分子，引起致癌与抑癌功能失衡，肝细胞获得遗传性增殖能力，导致肝癌发生是一个渐变过程［13］。在预防癌症同类候选药中，熊果酸抗癌优势在于作用广谱，主要表现为抗致癌，抗促癌［14］。枸杞子可以增强H22荷瘤小鼠脾脏中以树突状细胞 (DC)为主的抗原递呈细胞的功能，提示其抗肿瘤免疫作用机制可能与此有关［15］。但与熊果酸联合用药协同预防肝癌前病变的机制还有待研究。

本研究确定熊果酸抑制诱导性肝癌前病变进展，且与枸杞子联用效应增强。既探索了天然药物预防肝癌的研究思路，也提供中医临床处方用药的实验依据。

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