肝泰煎剂含药血清诱导人肝癌细胞系Bel-7402细胞的凋亡*

李东涛 阿古拉 张 红 王 剑

中国人民解放军济南军区青岛第一疗养院第二疗养区中医综合科 (山东青岛，266071)

肝泰煎剂 (GTJJ)是我们在临床上治疗原发性肝癌的主方。具有益气疏肝、活血软坚、解毒抗癌作用，临床应用显示，该方有抑制肿瘤生长及延长患者生存期的作用。为了深入研究其作用机制，我们设计了体外培养细胞的血清药理学实验，结果如下。

1 材料与方法

1.1 材料 新西兰大白兔12只，雌性，体重2.45～2.7kg，购于中国药品及生物制品检定所。对数生长期的Bel-7402细胞，由中国中医研究院广安门医院提供。GTJJ药物组成：柴胡、白芍、白术、云苓、水红花子、黄芪、鳖甲、藤梨根、冬凌草、干蟾皮、白花蛇舌草等，常规水提取，生药浓度3.4kg/L，4℃保存备用。GTJJ含药血清的制备：健康新西兰大耳白兔12只，随机分为NS(生理盐水)、GTJJ等效剂量(GTJJD，约为人用量的5倍)、GTJJ高剂量 (GTJJG，约为人用量的10倍)3组，每组4只，8∶00、14∶00时各给药1次。NS组兔灌喂10ml的生理盐水，后两组兔用中药每只每次稀释成10ml灌喂，重复给药5次，末次给药前12小时禁食不禁水，末次给药后1～1.5小时之内分别从耳中央动脉无菌采血10ml，室温静置2小时，冷冻离心机1 500r/min离心10分钟，吸取血清，56℃ 30分钟灭活，22μm针式微孔滤膜过滤，-20℃冰箱保存备用。顺氯氨铂 (DDP)：山东齐鲁制药厂产品。RPMI1640完全培养液：RPMI培养干粉 (GIBCO)内含2mmol/L谷氨酰胺、青霉素100ku/L、链霉素100mg/L，应用时加入100ml/L灭活的小牛血清。四甲基偶氮唑盐 (MTT)、碘化丙啶 (PI)、RNAA酶、吖啶橙 (AO)：美国Sigma公司产品。AnnexinV-FITC试剂盒：北京宝赛生物技术有限公司生产。全自动酶标仪 (Microplate AUTO Reader)EL311：美国BioTek公司产品。BH2-RFC落射式荧光显微镜：Olympus公司产品。激光共聚焦扫描显微镜 (Radiance2000)：美国Bio-Rad公司产品。FACSort流式细胞仪 (FCM)：美国Becton-Dicknson公司生产。

1.2 方法

1.2.1 GTJJ含药血清对人肝癌细胞系Bel-7402生长抑制作用处于对数生长期的人肝癌细胞Bel-7402经2.5g/L胰酶消化后，接种于96孔板中，每孔100μl(1×108/L)，孵育24小时，分组为NSD(生理盐水低浓度)、NSG(生理盐水高浓度)、GTJJDD(GTJJ等效剂量低浓度)、GTJJDG(GTJJ等效剂量高浓度)、GTJJGD(GTJJ高剂量低浓度)、GTJJGG(GTJJ高剂量高浓度)、DDP 7组;分别加入生理盐水兔血清至终浓度为100ml/L、200ml/L，GTJJ等效剂量兔血清至终浓度为 100ml/L、200ml/L，GTJJ高剂量兔血清至终浓度为100ml/L、200ml/L，DDP 2 mg/L。另设对照组为含培养细胞的培养孔单纯加入培养液100μl、空白组为不含培养细胞的空白孔单独加培养液。每组复孔为6个，置于37℃，50ml/L湿化的CO2培养箱中孵育。72小时后，沿培养孔边缘轻轻吸出上清100μl，加入MTT储液10μl(5g/L)，继续培养4小时，加入二甲基亚砜 (DMSO)100μl，震荡器轻微震荡后，用EL311型全自动酶标仪测其A值，测定波长570nm，参考波长630nm，计算对细胞的抑制率 (%) =［(对照组平均A值-空白组平均A值) -(药物平均A值-空白组平均A值)］÷ (对照组的平均A值-空白组平均A值) ×100%。

1.2.2 影像学观察方法［1，2］处于对数生长期的人肝癌细胞Bel-7402细胞，经2.5g/L胰酶消化后，分瓶，传代细胞处于对数生长期时分组为NSD、NSD+DDP、GTJJDD、GTJJDD+DDP、GTJJGD、GTJJGD+DDP 6组，加中药血清同1.2.1。加DDP各组DDP终浓度为4.5mg/L。50ml/L湿化的 CO2培养箱中孵育。PBS液离心洗涤1次，取少量细胞涂片，速入950ml/L冷乙醇固定10～15分钟，稍干;10g/L醋酸酸化30秒，0.1g/L AO染色8分钟;PBS液 (pH4.8) 洗涤1分钟后，0.01mol/L CaCl2分化 2分钟，再入 3个含 PBS液(pH4.8)的染色缸洗3次，每次数秒;PBS液临时封固，置荧光显微镜观察，蓝光激发，照相。另染色方法同AO染色，置激光共聚焦扫描显微镜观察［3］，蓝光激发 (B，488nm)，阻挡滤片530/30Bp、630/30Bp，发射波长515nm(DNA，绿光)、630nm(RNA，红光);采用该仪器的双染色样品扫描分析软件分析，照相。

1.2.3 GTJJ含药血清对人肝癌细胞系Bel-7402细胞周期的影响及诱导凋亡［4］传代细胞处于对数生长期时分组为NSD、NSG、GTJJDD、GTJJDG、GTJJGD、GTJJGG 6组。

PI染色：加中药血清同1.2.1。分别于孵育12、24、48、72小时时处理细胞。0.1mol/L PBS液离心洗涤 (1 000r/min，5分钟)两次后，加入700ml/L冷乙醇4ml，4℃固定24小时。检测前弃去乙醇，PBS液离心洗涤两次，加入RNAA酶(20mg/L)及PI(50mg/L)混合染液1ml，4℃避光染色30分钟。350目尼龙筛网过滤，调整瘤细胞浓度1×108/L，FCM检测，计算出DNA含量，得出细胞周期 (G0/G1，S，G2+M)的百分比和凋亡细胞的比例。

AnnexinV-PI双染：处理细胞同1.2.2，于孵育24小时时处理细胞。将培养液倒入5ml离心管，加入2.5g/L的胰酶消化，加入原培养液，混合后，1 000r/min 4℃离心10分钟，弃上清，加入冷PBS 1ml，轻轻震荡使细胞悬浮，1 000r/min 4℃离心10分钟，弃上清，重复上述步骤两次。将细胞重悬于 200μl Binding Buffer。加入 AnnexinV-FITC 10μl和 PI 5μl，轻轻混匀，避光室温反应15分钟或4℃反应30分钟。加入Binding Buffer 300μl，立即流式细胞仪分析。

2 结果

2.1 GTJJ含药血清对人肝癌细胞系Bel-7402的生长抑制作用见表1。

表1 MTT法测定GTJJ含药血清对人肝癌细胞系Bel-7402体外生长抑制

GTJJ含药血清均有不同程度抑制肿瘤生长作用，以20%GTJJ高剂量组含药血清作用显著，为50.09%，与NSD、NSG组比较，差异有显著性意义 (P＜0.01)，但与化疗药物DDP相比，各组还有一定差距。

2.2 影像学观察结果 荧光显微镜下AO染色 除NSD、NSG组外，各用药组均可发现明显的凋亡细胞，核染色质浓缩，早期染色质聚集于核周边部而呈新月形，晚期细胞核浓缩，并碎裂成大小不等的片段，晚期凋亡细胞进一步碎裂形成由质膜包绕的含有多少不等的核碎片的凋亡小体，细胞的细胞核染色质形成明亮的凝聚块，以各加DDP组最为明显。单纯加中药GTJJ各浓度组也显示有明显的细胞凋亡 (见插页图1)。激光共聚焦扫描显微镜下细胞的形态变化NSD、NSG组细胞大小相对均匀，为圆形，无缺损或破坏，DNA荧光强度分布地形图显示细胞分布茂密，整个结构形态充满，自核边缘至核中央荧光强度逐次递强，完整无损。各加药组细胞形态不规则，荧光强度分布不均，大面积出现荧光强度减低，各组均能发现细胞凋亡表现，单纯中药组以GTJJGD最为明显(见插页图2)。

2.3 GTJJ含药血清对人肝癌细胞系Bel-7402细胞周期影响及凋亡诱导 PI染色：在12小时点上，与NSD、NSG组相比，各加药组出现G0/G1期阻滞，以GTJJDD最为明显，未出现细胞凋亡现象。在24小时点上，各中药组均出现不同程度的细胞凋亡现象，并出现明显G0/G1期阻滞。在48小时点上，各加药组凋亡细胞数量增加，以GTJJDD最高，为16.2%，在72小时点上，凋亡细胞数量明显减少，但仍有G0/G1阻滞现象，由于此时出现细胞饥饿现象，NSD开始出现部分细胞凋亡 (表2，图3)。

表2 含药血清对Bel-7402细胞周期的影响及细胞凋亡的诱导情况

AnnexinV-PI双染：GTJJDD及GTJJGD组24小时点早期凋亡率并不高，但中晚期凋亡数量较高，因此凋亡总数比NSD组高，差异有显著性意义 (P＜0.001)。另外，中药加DDP比单纯用DDP(即NSD+DDP组)凋亡总数明显增高，差异有显著性意义 (P＜0.001)，显示中药与DDP的协同作用 (表3，图4)。

图3 PI染色FCM测定GTJJDD组含药血清48h时段对Bel-7402细胞周期影响及细胞凋亡的诱导情况

表3 GTJJ含药血清24小时时段对Bel-7402细胞凋亡的诱导情况

图4 AnnexinV-PI染色测定GTJJGD+DDP组含药血清24h时段对人肝癌细胞系Bel-7402早期凋亡诱导

3 讨论

细胞凋亡是中药抗癌的主要作用机制之一。针对肝癌而言，许多中药显示较好的诱导肝癌细胞凋亡作用。如浦洪琴等［5］证实中药抗癌灵具有诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用，其分子机制可能与上调caspase-3和下调survivin基因表达有关。朱丽红等［6］研究发现，吴茱萸碱能抑制人肝癌细胞HepG2的生长及诱导其凋亡。李伯利等［7］研究发现，冬凌草甲素能够明显抑制HepG2细胞增殖，并诱导肝癌细胞凋亡，其作用途径可能与上调PTEN mRNA表达有关。宋超等［8］研究发现，黄芩素能抑制HepG2细胞的增殖，促进其凋亡，其机制可能与miR-34a上调有关。以上说明许多中药通过诱导细胞凋亡而产生抑制肿瘤效果。我们测定GTJJ含药血清对人肝癌细胞系Bel-7402体外生长抑制作用，结果显示，肝泰煎剂有一定抑制肝癌细胞生长效果。荧光显微镜下AO染色，各用药组均可发现明显的凋亡细胞，激光共聚焦扫描显微镜观察显示，各组均能发现细胞凋亡现象。因此，我们认为，GTJJ含药血清有诱导肝癌细胞凋亡作用。

引起细胞凋亡典型形态学变化的机制在于Ca2+、Mg2+依赖性核酸内切酶的激活导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成以180～200bp为最小单位的单体或寡聚体片段。流式细胞仪PI染色法可以检测DNA降解，在正常的G0/G1峰之前出现的一亚二倍体峰为凋亡峰。我们通过PI染色法流式细胞学检查结果显示，GTJJ含药血清在药物作用24小时后，能出现明显的凋亡峰。但凋亡细胞数量较少，GTJJDG组细胞凋亡率为1.7%，但48小时后，GTJJDD为16.2%。

在各种细胞受到诱导后产生凋亡的初期，均会出现膜内外层面磷酯酰丝氨酸 (PS)重新分布，即膜内表面的PS发生不可逆转的外露，且明显早于核内DNA固缩、变性、裂解［9］，检测外表面的PS，可了解凋亡的早期状况。AnnexinⅤ与PS有较强的亲和力，具有钙依赖性。由于坏死细胞的PS也有外露现象［10］，因此，AnnexinV和能够进入破损细胞膜内与降解DNA结合的PI法联合应用才可以区分凋亡和坏死［11，12］。我们采用AnnexinⅤ/PI法双染色观察了用药24小时后早、中、晚期凋亡细胞分布，结果显示，GTJJ中药组在早、中、晚期均有诱导细胞凋亡作用，但与DDP相比，凋亡细胞数量相对较少，其中GTJJGD凋亡细胞数量为7.33%，说明中药诱导肝癌细胞凋亡比较和缓。以上说明，诱导肝癌细胞凋亡是肝泰煎剂抑制肝癌细胞生长的重要作用机制。

肝泰煎剂主要有柴胡、白芍、白术、云苓、水红花子、黄芪、炮山甲、鳖甲、藤梨根、冬凌草、干蟾皮、白花蛇舌草等药物组成，具有疏肝理气、益气健脾、活血软坚、解毒抗癌等功效，临床上应用本方为主治疗肝癌，取得较好疗效。现代研究证实：柴胡皂甙d与黄芪总黄酮皆能诱导K562细胞凋亡［13，14］;白芍总苷在体外能够抑制人肝癌细胞HepG2的增殖，并能诱导细胞凋亡［15］;藤梨根提取物诱导胃癌细胞凋亡［16］;不同浓度的微米冬凌草甲素能够诱导肿瘤细胞的caspase-3基因表达，引起细胞的凋亡，并呈剂量依赖性［17］;蟾皮提取液能诱导肾癌细胞凋亡，下调Fas及上调FasL和bcl-2表达［18］，白花蛇舌草可能通过诱导H22肝癌细胞移植瘤小鼠瘤组织HSP70表达，在一定程度上促进肝癌细胞凋亡而达到抗肿瘤的作用［19］。这些药物虽然在方中的中医配伍功效不同，但皆可诱导肿瘤凋亡，这也是中药复方肝泰煎剂能够有效地诱导肝癌细胞凋亡的基础。

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